金蓮花中葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠血清及組織抗氧化活性的動態影響

金蓮花中葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠血清及組織抗氧化活性的動態影響

屈海琪楊國棟蔣偉袁丹華王書華安芳

(河北北方學院藥學系，河北張家口075000)

摘要〔〕目的研究金蓮花中葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠血清總抗氧化能力(T-AOC)及組織細胞膜轉運酶活性動態變化及比較葒草苷和牡荊苷藥物抗氧化的構效關系。方法通過腹腔注射D-半乳糖，造成小鼠亞急性衰老，經過8 w造模并且驗證模型成功后，隨機分為正常組，模型組，維生素E對照組，葒草苷和牡荊苷低、中、高各三個劑量組，并從第9周開始各治療組每日上午分別口服灌胃給藥一次。給藥2、4、6、8 w后，分別斷頭處死衰老小鼠，測定血清T-AOC及腎、肝、腦組織中細胞膜轉運離子能力。結果葒草苷和牡荊苷具有提高衰老小鼠血清T-AOC及腎、肝、腦組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。與模型組相比，給藥2、4 w后，各劑量組血清T-AOC及組織中ATP酶活性雖有提高，但無統計學意義(P>0.05)，給藥6、8 w后，各劑量組血清T-AOC及組織中ATP酶活性顯著提高(P均<0.01)；葒草苷與牡荊苷相比，給藥2、4 w后，各劑量組在提高血清T-AOC及組織中ATP酶的活性無統計學意義(P>0.05)，給藥6、8 w后，紅草苷中、低劑量組在提高血清T-AOC及組織中ATP酶的活性上高于牡荊苷同等劑量組(P<0.05)，高劑量組相比無顯著差異(P>0.05)；給藥8 w后，葒草苷和牡荊苷中、低劑量組在提高血清T-AOC及組織中ATP酶的活性上低于VE(P<0.05)，而高劑量組與維生素E組相比無顯著差異(P>0.05)。 結論葒草苷和牡荊苷給藥6 w后，顯著提高D-半乳糖致衰老小鼠血清T-AOC活性，對D-半乳糖致衰老小鼠組織細胞膜轉運能力的保護作用顯著。其中，中、低劑量組葒草苷的抗氧化作用優于牡荊苷，葒草苷和牡荊苷的高劑量組與維生素E作用相當。

關鍵詞〔〕葒草苷；牡荊苷；D-半乳糖；抗氧化

中圖分類號〔〕R285〔

基金項目：張家口市科技局(11110015D)

通訊作者：安芳(1965-)，男，教授，碩士生導師，主要從事中藥有效成分的提取及藥理研究。

第一作者：屈海琪(1985-)，女，碩士，主要從事中藥有效成分提取分離及藥代學研究。

現代藥理研究表明，金蓮花中其主要活性成分是黃酮類化合物，具有抗病毒、抑菌、體外抑制多種腫瘤細胞株增殖的作用〔1～4〕。藥動學研究指出，葒草苷和牡荊苷在動物體內吸收、分布、起效均較為迅速，組織分布中尤以腎臟濃度最高〔5，6〕。研究還證實了金蓮花黃酮及單體葒草苷和牡荊苷良好的體內外抗氧化作用〔7，8〕，有關衰老動物體內抗氧化研究多僅限于一個時間點〔9，10〕，本實驗觀察給藥2、4、6、8 w后各時間點葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠血清總抗氧化能力(T-AOC)及組織中轉運酶活性的影響，比較葒草苷和牡荊苷保護細胞膜轉運能力作用的動態變化。

1材料與儀器

1.1試劑及藥品D-半乳糖(分析純)，上海試一化學試劑有限公司；牛血清蛋白(分析純)，鄭州益康有限公司；生理鹽水，石家莊第四制藥廠；T-AOC測試盒，南京建成生物有限公司(批號：20100610)；Na+-K+-ATP酶測試盒，南京建成生物有限公司(批號：20100920)；Ca2+-Mg2+-ATP酶測試盒，南京建成生物有限公司(批號：20100920)；考馬斯亮藍蛋白試劑盒，南京建成生物有限公司(批號：20100918)；N，N-二甲基甲酰胺，分析純，上海試一化學試劑有限公司；吐溫-80，分析純，上海試一化學試劑有限公司。葒草苷和牡荊苷(自制，經1H-NMR和HPLC鑒定，純度98.9%)。

1.2實驗動物昆明種小鼠(河北北方學院動物中心提供，許可證號：SCXK京2004-0001)，于18～25 ℃室溫下分籠飼養。

1.3動物分組健康的昆明種小鼠280只(雌雄各半)，隨機分為正常組、模型組、葒草苷和牡荊苷低、中、高各三個劑量組、維生素E對照組，適應性飼養1 w后造模。

1.4造模方法采用D-半乳糖致亞急性衰老法〔11〕，在500 ml生理鹽水中溶解10.0 g D-半乳糖，對小鼠進行腹腔注射，注射劑量為200 mg·kg-1·d-1，正常組以等體積生理鹽水替代，造模8 w，每天給藥劑量以小鼠體重變化來調整。

1.5給藥方法葒草苷和牡荊苷溶液的配制：葒草苷和牡荊苷較難溶于水，經預試，N，N-二甲基甲酰胺:吐溫-80：生理鹽水=1∶1∶20為溶劑。從第9周始每日上午，各治療組分別給予灌胃給藥維生素E組給藥劑量(20 mg/kg)，葒草苷、牡荊苷高中低三劑量組分別給藥劑量是40、20、10 mg/kg，每天的給藥劑量依據小鼠體重變化進行調整，模型組和正常組給等體積的溶劑。葒草苷和牡荊苷組給藥時間設定2、4、6、8 w，維生素E組給藥時間為8 w。

1.6血清T-AOC的測定機體中有許多抗氧化物質，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲琳類物質形成穩定的絡合物，通過比色，可測出其抗氧化能力的高低。給藥2、4、6、8 w后，小鼠斷頭取血，以4 000 r/min離心10 min，取血清按照試劑盒上說明要求操作。T-AOC(U/ml)=〔(A測定管-A對照管)/0.3〕×(反應液總體積/取樣的體積)×稀釋前的倍數。

1.7組織Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性測定分別處死給藥不同周期的小鼠后，準確稱取小鼠肝、腦、腎組織重量，按10%重量體積比制成組織勻漿液，再取一定量的勻漿液加99倍的生理鹽水制成0.1%的組織勻漿液0.1 ml，用考馬斯亮藍試劑測定組織蛋白。根據公式計算酶的活性。

1.8統計學方法采用SPSS16.0統計軟件進行LSD檢驗。

2結果

2.1葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠血清T-AOC的影響葒草苷和牡荊苷具有提高D-半乳糖致衰老小鼠血清中T-AOC的能力，與正常組〔(16.70±3.82)U/ml〕相比，模型組中小鼠血清T-AOC明顯低于正常組〔(8.91±1.13)U/L,P<0.01〕；與模型組相比，第2、4周葒草苷和牡荊苷各治療組小鼠血清T-AOC活性有所提高，但無顯著性差異；第6、8周，葒草苷和牡荊苷各治療組使小鼠血清T-AOC活性明顯提高(P<0.01)。給藥8 w后，葒草苷和牡荊苷中、低劑量對提高小鼠血清T-AOC活性作用上弱于維生素E組(15.06±1.40，P<0.05)；葒草苷和牡荊苷高劑量組與維生素E組相比無顯著差異(P>0.05)。葒草苷組與牡荊苷組相比，給藥2、4 w后，各劑量組提高小鼠血清T-AOC活性無顯著差異；給藥6、8 w后，葒草苷中、低劑量組提高小鼠血清T-AOC活性高于牡荊苷同等劑量組(P<0.05)；高劑量組間無顯著差異。見表1。

表1　葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠血清T-AOC的影響 ± s，U/ml)

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與維生素E組比較：3)P<0.05；與葒草苷中劑量組比較：4)P<0.05；與葒草苷低劑量組比較：5)P<0.05，表3、表4、表5同

2.2葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠體內組織細胞膜離子轉運能力的影響與正常組相比，模型組小鼠組織內Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，給藥2、4 w后，葒草苷和牡荊苷各治療組能夠提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，但無顯著差異(P>0.05)；給藥6、8 w后，葒草苷和牡荊苷各治療組明顯提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性(P均<0.05)，說明小鼠衰老后細胞膜的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯降低，而各治療組均具有升高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的作用。與維生素E組相比，給藥8 w后，葒草苷和牡荊苷中、低劑量組在提高組織細胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性上作用較弱(P<0.05)；高劑量組與維生素E組相比無顯著性差異(P>0.05)。葒草苷組和牡荊苷組相比，給藥2、4 w后，各劑量組在提高組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性上無顯著性差異(P>0.05)；給藥6、8 w后，葒草苷中、低劑量組在對組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性影響上作用明顯高于牡荊苷同等劑量組(P<0.05)；高劑量組之間相比無顯著性差異(P>0.05)。見表2～表5。

表2　各組衰老小鼠不同組織Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性

與模型組比較:1)P<0.01

表3　葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠腎組織中Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性的影響

表4　葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠肝組織中Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性的影響

表5　葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織中Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性的影響

3討論

人口老齡化使得與衰老相關因素的研究越來越受到人們的關注，至于衰老的機制目前還眾說紛紜，其中自由基學說被廣泛接受〔12〕。研究表明，由D-半乳糖誘導的衰老模型已逐漸用于老年病、衰老機制及抗衰老藥物篩選等方面的研究〔13〕。

T-AOC在機體防御體系中占據著重要的作用，通過清除機體內濃度過高的活性氧自由基，預防自由基機制的失衡，從而使機體保持在相對穩定的狀態，它可代表非酶促系統和抗氧化酶系統的變化〔14〕。老齡化過程中，病理生理尤為突出的一個重要環節是T-AOC水平的下降，也正是因此導致體內過多活性氧不能及時清除而造成積聚。這種機能的降低，常常導致疾病的發生和衰老的提前到來，因此體內的T-AOC水平的檢測就顯得尤為重要。本實驗結果顯示葒草苷、牡荊苷能夠有效地提高機體內T-AOC的活性，葒草苷在提高機體內T-AOC的活性方面要優于牡荊苷，這可能與葒草苷和牡荊苷的結構差異有關， B環上具有鄰二酚羥基的黃酮較B環上只連有單個酚羥基的黃酮氧化活性強。

Na+-K+-ATP酶活性與年齡的增加呈負相關，酶活性的降低使得細胞內ATP的生成減少，導致鈉離子轉運障礙，造成新陳代謝紊亂，從而使細胞的整體功能受到影響〔15〕。細胞內Ca2+的濃度大幅增加是ATP酶活性降低的另一結果，高水平的Ca2+將影響神經細胞的細胞骨架和膜結構，使穩定性降低，膜通透性增大，進而產生一系列惡性循環〔16〕。

本實驗在動態的抗氧化研究中發現，給藥周期為2～4 w時，葒草苷和牡荊苷還不能有效地發揮其抗氧化作用，當給藥周期為6 w時，其抗氧化能力已經與給藥8 w時無統計學差異，為今后抗衰老縮短給藥時間，發揮良好藥效，避免藥物體內積累，安全用藥提供了實驗依據。且葒草苷對于提高組織細胞膜轉運酶的活性高于牡荊苷，發揮抗氧化作用與維生素E相當。

4參考文獻

1蘇連杰，田鶴，馬麗英.金蓮花醇提物體內抗病毒作用的實驗研究〔J〕.中草藥，2007；38(7)：1062-4.

2Li YL,Ma SC,Yang YT,etal.Antiviral activities of flavonoids and origanic acid from Trollius chinensis Bunge 〔J〕.Ethnophopharmacol,2002;79(3):365-8.

3孫黎，劉芳，劉華，等.金蓮花黃酮對人體乳腺癌細胞作用的研究〔J〕.中國老年學雜志，2009；29(5)：1098-9.

4孫黎，羅強，張力，等.金蓮花黃酮對A549細胞生長及凋亡的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(1)：82-3.

5曲彩紅.金蓮花中葒草苷兔體內藥代動力學研究〔D〕.河北北方學院，2010.

6顏娟.金蓮花中牡荊苷兔體內藥代動力學研究〔D〕.河北北方學院，2010.

7田嘉銘，楊國棟，饒娜，等.金蓮花中葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰小鼠細胞膜轉運能力的影響〔J〕.中國老年學雜志，2012；32(9)：3945-7.

8蔣偉，屈海琪，袁丹華，等.金蓮花中葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠腦損傷的保護作用〔J〕.中草藥，2012；43(7)：1376-80.

9范紅艷，顧饒勝，王春艷，等.大豆異黃酮抗衰老作用研究〔J〕.中草藥，2010；41(12)：2054-7.

10遲曉星，張濤，錢麗麗，等.大豆異黃酮對青年雌性大鼠卵巢、子宮組織中Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達的影響〔J〕.食品科學，2010；31(11)：231-3.

11苗明三.五味子多糖對衰老模型小鼠的影響〔J〕.中國醫藥學報，2002；27(3)：187.

12Droge W.Oxidative stress and aging〔J〕.Adv Exp Med.Biol,2003;543:191-200.

13Cui X,Zou P,Zhang Q,etal.Chronic systemic D-galactose exposure induces memory loss，neurodegeneration，and oxidative damage in mice protective effects of R-alpha-lipoic acid〔J〕.Neurosci Res,2006;83:1584-90.

14李云，楊素青，張軍.急性致衰老動物模型的探討〔J〕.衛生研究，2002；31(4)：290-1.

15梁晚益，楊宗誠，黃躍生.線粒體Ca2+轉運與細胞代謝調節〔J〕.生理科學進展，2000；4(31)：357.

16Germann I,Hagelauer D,Kelber O,etal.Antioxidative properties of the gastrointestinal phytopharmaceutical remedy STW(Iberogast(R))〔J〕.Phytomedicine,2006;13(1):45-5.

〔2013-07-04修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)