不同濃度尿酸對培養人臍靜脈內皮細胞功能的影響

不同濃度尿酸對培養人臍靜脈內皮細胞功能的影響

王云開周金華

(南昌大學第一附屬醫院心血管內科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的探討尿酸對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)功能影響及可能機制分泌纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)蛋白的作用和可能的信號通路。方法分別用不同尿酸濃度〔蒸餾水(對照組)、119、238、476、952 μmol/L〕(n=6)干預體外培養的HUVECS 24 h，觀察其形態、增殖、培養液中PAI-1蛋白的影響。觀察476 μmol/L尿酸干預培養時，不同時間(1、3、6、12、24 h)對HUVECs培養液PAI-1蛋白及不同時間(15、30、60、120 min)細胞外信號調節激酶(ERK)1/2磷酸化水平的影響。用ERK1/2通路阻滯劑(PD98059，20 μmol/L)阻斷尿酸誘導HUVECS分泌PAI-1蛋白。結果與對照組比較，濃度476、952 μmol/L尿酸使細胞增殖減少，培養液中PAI-1蛋白增加(P<0.05)。濃度為476 μmol/L尿酸作用HUVECs不同時間(1、3、6、12、24 h)對PAI-1蛋白的影響呈時間依賴性。不同時間(15、30、60、120 min)促ERK1/2磷酸化水平升高，與0 min組比較(P<0.05)。預先給予PD98059(20 μmol/L)作用后，尿酸476 μmol/L+ PD98059(20 μmol/L)能阻斷PAI-1蛋白生成(P<0.05)。結論尿酸抑制HUVECs增生，增加PAI-1蛋白表達，同時增加ERK1/2磷酸化水平，ERK1/2通路阻滯劑PD98059部分抑制尿酸誘導HUVECS分泌PAI-1蛋白，尿酸通過ERK1/2信號通路誘導HUVECS分泌PAI-1蛋白。

關鍵詞〔〕人臍靜脈內皮細胞；細胞外信號通路1/2；纖溶酶原激活物抑制劑-1

中圖分類號〔〕R322.1〔

第一作者：王云開(1963-)，男，碩士，主任醫師，碩士生導師，主要從事冠心病及高血壓研究。

血清尿酸濃度的升高與氧化應激、內皮功能障礙、血管平滑肌細胞增殖等有密切聯系，認為高尿酸是心血管事件的一項獨立危險因素〔1～3〕。正常濃度的尿酸在人體血漿中是重要的抗氧化劑，60%的尿酸具有清除自由基的功能。但尿酸濃度升高到一定程度，達到高尿酸血癥水平時，尿酸的抗氧化能力則被氧化應激所掩蓋，從而導致心血管事件的發生〔4〕。而另有一些研究認為〔5〕，心血管疾病往往伴隨尿酸排泄減少及尿酸產生增加的因素，像腎小球濾過率的下降、高胰島素血癥、腎血管收縮、利尿劑的使用以及組織缺血、氧化應激等，因此認為高尿酸是心血管疾病產生的結果。研究表明，高尿酸與高血壓、胰島素抵抗、肥胖、高脂血癥、糖耐量異常等因素協同作用〔6〕，加重動脈硬化，促進心腦血管疾病的發生。本實驗以人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)為模型，探討尿酸是否激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號途徑，使細胞外信號調節激酶(ERK)ERK1/2磷酸化，繼而誘導人臍靜脈內皮細胞分泌纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1。

1材料與方法

1.1主要試劑尿酸,PD98059,p-ERK1/2-抗(Santa Cruz公司，美國)；SuperECL Plus超敏發光液(北京普利萊基因技術有限公司，中國)；PAI-1 ELISA試劑盒(上海太陽生物技術公司，中國)；HUVECs(南京凱基生物公司，中國)；總蛋白提取試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所，中國)。

1.2方法

1.2.1HUVECs的體外培養HUVECs復蘇,傳代培養,HUVECs的計數處理，按白細胞計數法，計數4個角的4個大方格的細胞總數，細胞濃度(細胞數/ml)=4個大方格內的活細胞/4×104×稀釋倍數。

1.2.2細胞增殖的測定接種培養96孔培養板每孔中加入細胞懸液100 μl，密度為1×105/ml置于37℃、5%二氧化碳的孵箱內培養24 h后，將不同濃度的尿酸(119、238、476、952 μmol/L)分別加入長成良好的單層細胞中，每種濃度設6個復孔，對照組(蒸餾水)各6孔，使每孔最終體積為200 μl。MTT法于各孔內加入5 mg/ml MTT液0.02 ml，再培養4 h。在酶聯免疫檢測儀上測定490 nm波長處的吸光度值。

1.2.3PAI-1蛋白水平的測定將生長良好的HUVES密度調整為3×104個/ml,接種于24孔培養板中,37℃ 5%二氧化碳孵箱中培養,當達到80%的細胞呈匯合狀態,換用無血清培養基同步24 h。

1.2.4實驗分組①不同濃度尿酸作用24 h對HUVECs培養液中PAI-1的影響：對照組(蒸餾水)、尿酸(119、238、476、952 μmol/L)組。②尿酸476 μmol/L組作用不同時間(1、3、6、12、24 h)對HUVECs培養液中PAI-1的影響。③PD98059對尿酸作用HUVECS分泌PAI-1的影響。PD98059預處理1 h后再加尿酸476 μmol/L,每組設為4個復孔,取上清液，-20℃保存備用。

1.2.5ELISA檢測PAI-1蛋白含量按試劑盒進行實驗:①試劑重建,②加樣,③洗滌,④加酶標抗體,⑤洗滌,⑥顯色,⑦終止,⑧比色。數據處理：以A490對PAI-1標準品(ng/ml)在雙對數坐標系上作標準曲線，待測樣品PAI-1含量(ng/ml)可從標準曲線上查出其濃度。

1.2.6ERK1/2磷酸化水平的影響取第三代HUVECs，按照上述方法，以2×105/孔接種于6孔培養板中，用不含血清的RPMI-1640液培養以調節細胞生長的同步，24 h后去上清，并記為0時刻，按照試驗分組，改用尿酸476 μmol/L培養細胞120 min，分別在0、15、30、60、120 min收集細胞樣本。

1.2.6.1蛋白含量測定①制作標準曲線：按說明書配制。②檢測樣品蛋白含量。

1.2.6.2測定細胞t-ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達①對齊玻璃板，夾緊，短面朝外，垂直卡在架子上。②配制10%分離膠10 ml三蒸水3.95 ml；30 % 丙烯酰胺 3.3 ml；1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 ml。③混勻。④配置5%濃縮膠5 ml；三蒸水3.4 ml；30 % 丙烯酰胺0.83 ml；1.0 mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.63 ml。⑤混勻。⑥用流水沖洗濃縮膠。⑦上樣。⑧電泳。⑨轉膜。⑩膜的封閉和抗體孵育。結果檢測：以X光膠片曝光。圖片掃描保存為電腦文件，并用Bandscan分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數字化。Western印跡結束后進行剝脫實驗，然后用相應的total ERK抗體進行檢測。X-ray膜掃描。對于每個樣品，用p-ERK條帶的強度除以t-ERK條帶的強度。

1.3統計學方法采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析及q檢驗。

2結果

2.1倒置顯微鏡HUVECs形態學觀察接種于96孔板，至細胞生長貼壁，對照組HUVECs形態為薄橢圓形、多角形或長多角形,形態不一,胞質豐富且清輪廓清晰,細胞融合成單層,貼壁生長,形成典型的“鋪路石樣”結構。尿酸誘導后HUVECs形態:尿酸(119、238 μmol/L)作用24 h細胞形態基本正常，對照組無明顯差別，隨著濃度的增加,細胞損傷程度逐漸加重，尿酸476 μmol/L作用24 h后細胞稍被拉長,細胞形態較規則，稍皺縮。尿酸952 μmol/L作用24 h后出現明顯的形態變化,細胞明顯拉長，皺縮明顯,細胞間隙增大。見圖1。

圖1　各組培養的HUVECs 24 h鏡下形態(×100)

2.2不同濃度尿酸作用HUVECs 24 h對細胞增殖影響尿酸(119、238 μmol/L)組(0.679±0.016、0.670±0.028)與對照組(0.689±0.015)相比,對內皮細胞增殖的影響不明顯。尿酸(476、952 μmol/L)組(0.584±0.021、0.540±0.020)與對照組相比,細胞增殖隨濃度增加而減少(P<0.05)。

2.3不同濃度尿酸作用HUVECS 24 h對培養液中PAI-1蛋白的影響ELISA結果：對照組能誘導HUVECS分泌PAI-1(26.26±3.43)ng/ml，分別與尿酸(119、238 μmol/L)組(30.29±4.41、34.33±1.04)ng/ml比較,差異無統計學意義(P>0.05)，分別與尿酸(476、952 μmol/L)組(67.83±6.35、77.4±10.36)ng/ml比較,PAI-1蛋白差異均有統計學意義(P<0.05)。尿酸952 μmol/L組PAI-1蛋白分泌達高峰,與尿酸476 μmol/L組比較，PAI-1蛋白濃度差異無統計學意義(P>0.05)。尿酸誘導HUVECS分泌PAI-1蛋白的量隨濃度的增加而增加,呈濃度依賴性。

2.4尿酸(476 μmol/L)組作用HUVECs不同時間對培養液中PAI-1蛋白的影響ELISA結果：隨尿酸作用時間的延長，PAI-1蛋白分泌量亦增加,呈時間依賴性。6、12、24 h(9.95±0.13、26.47±3.35、84.90±8.74)ng/ml分別與1 h(1.39±0.01)ng/ml PAI-1蛋白比較，均有統計學意義(P<0.05)。

2.5尿酸對HUVECs ERK1/2磷酸化水平的影響Western印跡結果顯示，HUVECs同時表達ERK蛋白的2種亞型，即ERK1和ERK2，分子量分別為42和44 kD。對照組p-ERK1/2蛋白表達活性很低，與尿酸476 μmol/L刺激HUVECS不同時間段比較，總ERK1/2蛋白沒有變化，但p-ERK1/2蛋白表達明顯增高，尿酸作用30 min組p-ERK1/2表達條帶增強最明顯，與對照組相比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.6PD98059對尿酸作用HUVECS分泌PAI-1的影響ELISA結果顯示，對照組PAI-1蛋白表達很低(26.26±3.43)。尿酸476 μmol/L組較對照組明顯增多(67.83±6.35,P<0.05)；預先給予ERK1/2通路阻滯劑PD98059(20 μmol/L)作用后，與尿酸組476 μmol/L 比較，阻斷尿酸誘導的PAI-1蛋白生成差異有統計學意義(50.04±4.34,P<0.05)。

p-ERK1/2：(both bands)細胞外信號調節酶1/2 Western印跡條帶；t-ERK1/2:(total)細胞外信號調節酶1/2 Western印跡條帶 圖2　尿酸476 μmol/L作用HUVECs 不同時間對ERK1/2磷酸化水平的影響(n=3)

3討論

本實驗說明高濃度的尿酸對HUVECs有損害作用。組織型纖溶酶原激活物(t-PA) 和尿激酶纖溶酶原激活劑(u-PA)是纖溶激活系統的主要激活劑，使纖溶酶原變成纖溶酶，而纖溶酶的形成的調節主要通過PAI-1，PAI-1是t-PA和u-PA生理性抑制劑〔7〕。也有研究發現一些細胞因子通過ERK1/2通路誘導人平滑肌內皮細胞〔8〕、鼠腎小球膜細胞〔9〕分泌PAI-1。

在冠狀動脈循環中，t-PA和u-PA與血栓調節素結合起主要的內源性防止血栓形成作用，因此，PAI-1的增加有可能增加冠狀動脈血栓形成的危險，有實驗和流行病學數據支持PAI-1導致缺血性心血管疾病的發展〔10〕，在年輕的急性心肌梗死生存者中測定PAI-1明顯增加，在心梗生存者中血漿PAI-1活性亦增加，導致再發心肌梗死，在中年男女中，PAI-1抗原與活性增加了心梗的風險〔11〕，且獨立于其他傳統的危險因素，低血漿纖溶活性反映了PAI-1活性的增加，有可能增加年輕男性患缺血性心臟病的風險〔12〕。也有實驗證據支持這些流行病學數據，使用轉基因小鼠產生穩定型人類PAI-1過表達，發展成冠狀動脈血栓形成和心肌梗死〔13〕。

本實驗發現尿酸呈時間及濃度依賴性的誘導HUVECs PAI-1分泌。MAPK信號轉導通路是尿酸的重要信號通路之一。PD98059可以有效地減弱尿酸對PAI-1蛋白合成的促進作用，說明ERK通路是PAI-1合成的上游調節因素，參與尿酸上調PAI-1表達的機制。本文發現ERK1/2通路拮抗劑PD98059不能完全阻斷尿酸促進PAI-1的合成作用，其原因可能是任何一條信號通路的作用都不是獨立的，胞內各信號之間相互協同、相互制約的關系對完成刺激的傳遞過程十分重要。尿酸可能同時激活了細胞內(包括P38、PI-3激酶通路等)的多條信號轉導通路，而各信號通路之間普遍存在的信號串話現象，使得尿酸的刺激作用不能完全被PD98059阻斷。

近年來尿酸與心血管疾病間的關系越來越受關注，目前公認的觀點是高濃度的尿酸具有致心血管疾病的作用。本研究初步證實了尿酸通過ERK1/2途徑誘導內皮細胞PAI-1合成，有助于更好地理解尿酸與冠心病之間的關系。

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〔2013-10-29修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)