艾灸對類風濕關節炎模型大鼠滑膜病變的影響

艾灸對類風濕關節炎模型大鼠滑膜病變的影響

江星孫志嶺周丹萍徐驍王苗苗王富強1許志洋1紀偉2

(南京中醫藥大學護理學院，江蘇南京210023)

摘要〔〕目的應用蛋白質組學技術觀察艾灸對類風濕關節炎模型大鼠滑膜病變的影響。方法48只雄性SD大鼠，隨機選取6只作為正常組，余42只建立Ⅱ型膠原誘導的關節炎模型，其中造模成功的36只隨機分為6組：艾灸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每組6只。艾灸組選取雙側“足三里”、“腎俞”穴治療，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別干預1、2、3 w。模型組不治療。7組大鼠分別收集滑膜組織標本，雙向電泳。軟件分析比對各時間點艾灸組、模型組以及正常組。選取各時間點模型組與艾灸組共同差異蛋白點，應用MALDI-TOF MS鑒定，IPA軟件分析差異蛋白的生物功能、信號通路及信號網絡。結果①成功建立了各組關節滑膜雙向凝膠電泳圖譜。②發現并鑒定各時間點艾灸組與模型組共同差異蛋白質9個，PRDXⅠ，EHHADH，MLC3，HPX等蛋白主要通過自身變化調節脂肪酸β-氧化通路Ⅲ、NRF2-介導的氧化應激反應通路、急性期反應通路、細胞骨架肌動蛋白通路、上皮細胞黏附通路等，從而參與功能涉及DNA復制、重組和修復、細胞集結和炎性反應的信號網絡，最終調控本研究中RA的發生與發展。結論PRDXⅠ，EHHADH，MLC3，HPX等蛋白具有潛在的作為艾灸治療RA靶點或療效標志物的意義，為進一步研究艾灸作用機制提供蛋白質組學依據。

關鍵詞〔〕艾灸；類風濕關節炎；膠原；雙向凝膠電泳；質譜；滑膜

中圖分類號〔〕R593.22〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81173158)；江蘇省高校自然科學

通訊作者：孫志嶺(1970-)，男，博士，副教授，主要從事中西醫結合治療風濕病學研究。

1南京醫科大學大型儀器中心2江蘇省中醫院風濕免疫科

第一作者：江星(1983-)，女，碩士，講師，主要從事中西醫結合治療風濕病學研究。

類風濕關節炎(RA)是一種病因不明的全身性自身免疫性疾病，以關節滑膜病變、骨質侵蝕為主要特征，其病理特點是關節滑膜的反復慢性炎性反應、血管翳形成，由此引起軟骨吸收、骨質破壞和骨纖維化〔1，2〕。本研究應用雙向凝膠電泳(2-DE)及質譜比較艾灸干預后不同時間點的共同差異蛋白，并進行IPA分析，旨在尋找艾灸治療RA目的蛋白及其信號通路與信號網絡，探究艾灸療法作用機制。

1材料與方法

1.1實驗場所與動物本實驗在南京中醫藥大學SPF級動物實驗中心完成。SPF級飼養條件：自由滅菌飲食、光/暗周期12 h/12 h(光照時間06：00～18：00)、背景噪音(40±10)db、溫度(20±3)℃、相對濕度40%～50%。健康、雄性Sarague-Dawley(SD)大鼠48只，SPF級，體重200～250 g，購于北京維通利華動物實驗中心〔SCXK (京) 2012-0001〕。

1.2主要試劑與儀器純乙酸、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司；牛Ⅱ型膠原購自美國Chondrex公司；二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酞胺(Iodoacetmaide)、丙烯酞胺(Acrylmaideine)、甲叉雙丙烯酞胺(Disacylmaide)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、3-〔(3-膽酰胺丙基)-二乙胺〕-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、硫代硫酸鈉、瓊脂糖、固相pH梯度干膠條IPG strip(pp～10 NL，24 cm)、固相pH梯度膠條緩沖液(IPGB，Pp～10 NL)等購自美國Amersham公司。

IPG phor等電聚焦儀，Ettan Dalt Ⅱ垂直電泳系統、Image Master 2D 5.0圖像分析軟件均為美國Amersham公司產品。基質輔助激光解析/電離飛行時間串聯質譜分析儀(MALDI-TOF/TOF-MS：Ultraflex Ⅱ型)為德國Bruker公司產品。

1.3施灸材料無煙艾灸選擇南陽萬春堂天然艾草生物制品開發有限公司生產，規格：7 mm×12 mm。

1.4方法

1.4.1動物模型制備、實驗分組及艾灸方法SD大鼠48只，按隨機數字表法分出6只為正常組，42只建立Ⅱ型膠原誘導的關節炎模型。參照文獻〔3〕方法，牛Ⅱ型膠原溶解在0.05 mol/L的醋酸中，配制成2 mg/ml的膠原溶液，4℃過夜。冰浴條件下，用樣本均質儀低速混合時滴加等體積的完全弗氏佐劑，配制Ⅱ型膠原乳劑(終濃度為1 mg/ml)。以每只200 μl于鼠尾根部皮下注射免疫，7 d后按照上述方法100 μl鼠尾基部皮內注射二次免疫。納入實驗的42只大鼠有8只造模失敗，造模成功的36只大鼠隨機分為6組，艾灸Ⅰ組，艾灸Ⅱ組，艾灸Ⅲ組，模型Ⅰ組，模型Ⅱ組，模型Ⅲ組，每組6只。

參考文獻各組大鼠均定穴剃毛，捆縛于鼠板。〔4〕，艾灸組取大鼠腎俞穴(第二腰椎棘突下，左右旁開7 mm)和足三里穴(膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處)，點燃的無煙艾條垂直固定在灸架上保持與穴位距離2 cm (施灸過程中統一按照腎俞穴-對側腎俞穴-足三里-對側足三里的順序)，每穴灸20 min。Ⅰ組干預1 w，Ⅱ組干預2 w，Ⅲ組干預3 w。

1.4.2滑膜組織預處理每組干預結束后，大鼠處死剝離膝關節滑膜，迅速放入液氮凍存。同組滑膜組織等量混合，按約1∶8(m/V)的比例加入組織裂解液〔7 mol/L Urea、2 mol/L Lhtiourea，2% Pharmalyte(pp～10)，2% NP-40，1% Triton X-100，0.5 mmol/L EDTA，40 mmol/L Tris，4%CHAPS，100 mmol/L DTT，5 mmol/L PMSF〕。室溫下靜置孵育1 h，其間每隔15 min渦旋一次×3 s，然后以1 200 r/min，4℃離心1 h，吸取上清即為組織中的總蛋白質。取少許(1 μl)組織總蛋白用Bradford法測蛋白質濃度，其余上清分裝，-80℃保存備用。

1.4.3蛋白質雙向凝膠電泳按IPGphor等電聚焦系統指南及Sun等〔5〕的方法設IPGphor 儀器運行參數：設置程序水化和聚焦均在20℃下進行，電流為每根膠條7 μA，總電壓時間69 920 Vh，其中水化在30 V低電壓下進行1 h，然后經過500 V 1 h、1 000 V 1 h，最后穩定在8 000 V等電聚焦8.5 h。等電聚焦后，取出膠條于平衡緩沖液中平衡2次，平衡后在12.5%SDS-PAGE均勻膠上行第二向電泳。銀染染色，每份蛋白樣品均重復電泳3次。

1.4.4凝膠蛋白圖譜分析應用Image Scanner掃描儀進行掃描，Image Master 2D 5.0軟件進行包括蛋白點的檢測、量化、背景扣除和點的匹配等圖像分析。以正常組滑膜蛋白作為對照，將艾灸組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)與模型組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)對應比較，計算蛋白變化量的比值，以比值>1.2〔6〕或<0.83〔7〕的點以及是有或無差別的蛋白點作為后續質譜鑒定及IPA分析的候選蛋白點。

1.4.5質譜鑒定與數據庫查詢需鑒定的差異蛋白點經切割、脫色、還原、烷基化、胰蛋白酶酶解、萃取及脫鹽后，利用質譜儀測得各自肽質量指紋圖譜，并以基質峰、酶自動降解片段峰進行校正。所得肽質量指紋圖譜用Mascot搜索引擎檢索NCBI、MSDB蛋白質數據庫。參數設置為每個肽允許有1個不完全裂解位點，且肽片段分子量最大容許誤差為±100 ppm，蛋白質匹配分數>54分，物種來源為大鼠。

1.4.6差異蛋白的生物信息學分析采用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)軟件分析經鑒定的差異蛋白質的生物功能、信號通路，并繪制信號轉導網絡圖。

2結果

2.1雙向凝膠電泳分析結果各組大鼠關節滑膜蛋白質雙向凝膠電泳銀染圖譜清晰，蛋白質點分離完全，每張血清凝膠圖

譜辨識(1 316.7±24.7)個蛋白點，并顯示良好重復性與穩定性。經過背景消減后，分別將其中一塊凝膠作為參考膠進行3塊凝膠間的蛋白質點匹配，組內蛋白點平均匹配率90%～93%。比對后發現，模型Ⅰ組與艾灸Ⅰ組有365個差異點；模型Ⅱ組與艾灸Ⅱ組有332個差異點；模型Ⅲ組與艾灸Ⅲ組有202個差異點。選取三個時間點共同表達的9個差異蛋白點，作為艾灸治療持續變化及發揮作用的差異蛋白。這9個蛋白質點在2-DE凝膠上的具體位置見圖1。用蛋白點的灰度值代表蛋白表達豐度進行不同時間點差異蛋白點(Spot 1～9)的組間定量比較結果見表1。

2.2部分差異表達蛋白質的質譜鑒定根據2-DE結果，獲得9張肽質量指紋圖譜(PMF)，進入Matrix Science Mascot檢索界面，9個共同表達的差異蛋白具體名稱和相關信息見表2。

圖1　9個共同差異蛋白點在凝膠上的具體位置

SpotNo.正常組艾灸Ⅰ組模型Ⅰ組艾灸Ⅱ組模型Ⅱ組艾灸Ⅲ組模型Ⅲ組10.0000±0.000000.0879±0.006580.1400±0.008590.0000±0.000000.0362±0.010570.0152±0.013300.0639±0.0121220.0820±0.018260.2038±0.003450.1485±0.005500.1755±0.035800.2567±0.019640.0899±0.020760.1590±0.0261830.6041±0.047730.2961±0.008680.2014±0.012690.4886±0.091080.3127±0.042780.5331±0.032240.9268±0.0241240.3101±0.038930.0659±0.013900.0362±0.006950.1931±0.040520.0988±0.012280.2235±0.010070.3592±0.0393750.0146±0.004220.0198±0.004800.0304±0.002680.0028±0.004800.0221±0.006670.0153±0.005660.0285±0.0049160.1732±0.059280.3737±0.046140.2340±0.026940.3033±0.011120.3703±0.039820.2007±0.027850.2996±0.0323870.0398±0.010170.0607±0.013060.0334±0.006550.0429±0.009960.0804±0.005640.0265±0.006870.0562±0.0019080.2393±0.032550.1595±0.011630.0494±0.022220.1551±0.023790.2643±0.038210.0514±0.045530.1428±0.0335990.0000±0.000000.0131±0.011930.0643±0.013900.0000±0.000000.0344±0.012060.0333±0.009960.0047±0.00813

表2　9個蛋白質點具體名稱及相關信息

2.3差異蛋白的IPA分析結果9個差異表達蛋白，4個(DLG 5、TMEM 71、E3 ubiquitin-protein ligase、dihydrolipoyl dehydrogenase)由于未能檢索到對應的鼠源性Uniport AC，1個(uncharacterized C6orf 163)未搜索到IPA數據，最終得到4個蛋白〔過氧化物還原酶(PRDX)Ⅰ、EHHADH、肌球蛋白輕鏈(MLC)3、血紅素結合蛋白(HPX)〕的IPA分析結果，包括生物功能分析、信號通路分析及信號網絡分析。

2.3.1差異蛋白的生物功能分析結果表3列出IPA分析獲得的4個蛋白(PRDXⅠ、EHHADH、MLC3、HPX)與RA相關度較高的生物功能。

表3　IPA分析與RA相關度較高的生物功能

以-Log(P值)表示分析結果的富集度，-Log(P值)越大，富集程度越好，參與該項生物功能的蛋白就越多，反之越少

2.3.2差異蛋白的信號通路分析結果IPA分析結果發現31條信號通路，其中富集度最高的通路是脂肪酸β-氧化通路Ⅲ(Fatty Acidβ-oxidation Ⅲ)，其他與RA密切相關的通路有急性期反應(Acute Phase Response Signaling)、上皮細胞黏附通路(Epithelial Adherens Junction Signaling)、細胞骨架肌動蛋白通路(Actin Cytoskeleton Signaling)等。見表4。

表4　IPA分析與RA相關度較高的信號通路

以-Log(P值)表示富集度，較高代表此類通路被大量啟用；Ratio是指此類通路的激活程度，較高代表此類通路激活程度大(信息傳遞頻繁、信息傳遞量大)

2.3.3差異蛋白的信號網絡分析結果通過IPA軟件分析，我們得到模型組與艾灸組共同差異蛋白參與的網絡信息圖——涉及DNA復制、重組和修復；細胞集結和炎性反應網絡。由圖2可以發現，該網絡信息圖由1個(EHHADH)上調與4個(PRDXⅠ、MLC3、HPX)下調的差異蛋白參與，其中PRDXⅠ在網絡中與其他蛋白的相互作用最密切，提示在網絡通路中具有重要的作用。

圖2　差異蛋白信號網絡分析結果

3討論

本研究發現，PRDXⅠ、EHHADH、MLC3、HPX蛋白全都有可能參與了造模后的改變，3個蛋白(PRDXⅠ、MLC3、HPX)參與了艾灸調控過程。IPA分析發現，這4個蛋白參與的所有生物功能中，與RA密切相關的主要有器官形態、骨骼肌肉功能、免疫功能、炎性反應和疾病、血液系統功能、結締組織功能等。

PRDXⅠ是重要的過氧化物酶(Prxs)，能清除過氧化物，保護機體免受氧化損傷和參與信號傳導等重要生理功能〔8〕。有研究發現RA患者抗CCP水平與滑膜液中氧化活性指標(如MDA、MPO)呈正相關〔9〕，說明RA病變過程中氧化應激發揮著重要的作用〔10〕。本研究發現，模型組PRDXⅠ表達上調，推測由此導致的滑膜氧化應激反應是其持續炎癥的原因之一；艾灸后低表達，推測艾灸可能通過下調PRDXⅠ表達，調整氧化-抗氧化系統的平衡。有學者認為MLC經調節與Ca2+的結合來調節肌肉收縮與舒張頻率〔11〕。本研究發現，當模型組MLC3與正常組相比下調時艾灸使其上調，當MLC3與正常組相比上調時艾灸則使其下調，很顯然艾灸對MLC3在肌肉收縮過程中的調控起著非常重要的雙向調節作用。 HPX與血紅素結合能力最強，它最重要的功能是結合并轉運有毒的游離血紅素。研究提示〔12〕，HPX具備抗氧化、抗凋亡、免疫調節、器官保護等多種功能，并參與細胞分化以及細胞外基質重建等生理過程。本研究顯示艾灸對模型組HPX表達水平有負反饋作用，提示艾灸在RA中顯示出明顯的免疫調節作用。

本文發現EHHADH主要參與調控脂肪酸β-氧化通路Ⅲ，PRDX1主要參與調控NRF2-介導的氧化應激反應通路等。提示造模使該通路激活，艾灸可能通過下調此通路緩解氧化應激導致的炎癥反應和組織損傷。與RA密切相關的其他通路如細胞骨架肌動蛋白通路的激活驗證了RA病理過程中伴隨著軟骨侵蝕〔13〕，同時提示艾灸通過對此通路的調節發揮調控HPX的關鍵作用。而急性期反應、上皮細胞黏附功能的激活則是機體應對炎癥時的一般反應，同時炎癥也對此通路產生影響〔14〕，提示艾灸可能通過作用于這兩個通路發揮其干預作用。

本研究發現，PRDXⅠ在網絡中與其他蛋白的相互作用最密切，PRDXⅠ與LEP、UBC相鄰，LEP可與EHHADH及HPX聯系，UBC可與MLC3聯系，從而構成了4個差異蛋白在整個信息網絡中的聯絡。提示PRDXⅠ在網絡通路中具有關鍵作用，處于信息網絡的核心位置。結合蛋白生物功能分析和信號通路分析結果，艾灸極有可能通過作用于NRF2-介導的氧化應激反應通路下調PRDXⅠ，從而調節RA的發生與發展。

4參考文獻

1中華醫學會風濕病學分會.類風濕關節炎診斷及治療指南〔J〕.中華風濕病學雜志，2010;14(4)：265-70.

2Zhang Y，Guo Z，Zou L，etal.A comprehensive map and functional annotation of the normal human cerebrospinal fluid proteome〔J〕.J Proteomics，2015；119(1)：90-9.

3Cai X，Zhou H，Wong Y F，etal.Suppression of the onset and progression of collagen-induced arthritis in rats by QFGJS，a preparation from an anti-arthritic Chinese herbal formula〔J〕.J Ethnopharmacol，2007；110(1)：39-48.

4李忠仁.實驗針灸學〔M〕.第2版.北京：中國屮醫藥出版社，2007:255-7.

5Sun ZL，Zhu Y，Wang FQ，etal.Serum proteomic-based analysis of pancreatic carcinoma for the identification of potential cancer biomarkers〔J〕.Biochim Biophys Acta，2007；1774(6)：764-71.

6Wu J，Wang F，Gong Y，etal.Proteomic analysis of changes induced by nonylphenol in Sprague-Dawley rat Sertoli cells〔J〕.Chem Res Toxicol，2009；22(4)：668-75.

7祝皓.痹腫消湯及其有效成分阿魏酸干預膠原誘導性關節炎大鼠的定量蛋白質組學研究〔D〕.長沙：中南大學，2014.

8Wood ZA，Schroder E，Robin HJ，etal.Structure，mechanism and regulation of peroxiredoxins〔J〕.Trends Biochem Sci，2003；28(1)：32-40.

9朱芳玉.類風濕關節炎抗CCP抗體與氧化和抗氧化活性的相關性研究〔J〕.國際檢驗醫學雜志，2012;(21)：2576-7.

10Kim CW，Cho EH，Lee YJ，etal.Disease-specific proteins from rheumatoid arthritis patients〔J〕.J Korean Med Sci，2006；21(3)：478-84.

11Baylor SM，Hollingworth S.Intracellular calcium movements during excitation-contraction coupling in mammalian slow-twitch and fast-twitch muscle fibers〔J〕.J Gen Physiol，2012；139(4)：261-72.

12董貝貝，朱芳蕓，魏海東，等.血紅素結合蛋白生化物性及應用研究進展〔J〕.中國實驗血液學雜志，2013；21(2)：513-6.

13Trickey WR，Vail TP，Guilak F.The role of the cytoskeleton in the viscoelastic properties of human articular chondrocytes〔J〕.J Orthop Res，2004；22(1)：131-9.

14Venteclef N，Jakobsson T，Steffensen KR，etal.Metabolic nuclear receptor signaling and the inflammatory acute phase response〔J〕.Trends Endocrinol Metab，2011；22(8)：333-43.

〔2015-03-17修回〕

(編輯徐杰)