淫羊藿苷促進軟骨細胞體外3－D培養下生成軟骨

淫羊藿苷促進軟骨細胞體外3-D培養下生成軟骨

王鵬珍萬超1

(暨南大學生命科學與技術學院,廣東廣州510632)

摘要〔〕目的探究淫羊藿苷(ICA)對軟骨細胞在體外3-D培養條件下的作用。方法將胎鼠原代軟骨細胞分成對照組和ICA濃度梯度組，通過MTT法、阿爾新藍染色、酶聯免疫吸附法，確定出ICA最有效濃度為10-6 mol/L，并將此濃度用于后續軟骨生成實驗。軟骨細胞接種于Gelfoam?上，形成復合塊，分為對照組和ICA組，進行形態學和免疫組化以及 Real-time PCR分析。結果細胞培養14 d時，ICA能顯著促進膠原蛋白和蛋白聚糖分泌。此外，利用Gelfoam?進行軟骨細胞3-D培養，ICA促使軟骨細胞中蛋白聚糖、膠原蛋白(collagen)Ⅱ，HIF-1α和Sox9在mRNA和蛋白水平表達均顯著上調，且與對照組相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論淫羊藿苷可以促進軟骨細胞在體外3-D培養條件下生成軟骨。

關鍵詞〔〕淫羊藿苷；軟骨細胞；膠原蛋白；蛋白聚糖；羥脯氨酸

中圖分類號〔〕Q813〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81171717)

通訊作者：萬超(1972-)，男，教授，主要從事軟骨疾病治療與修復研究。

1香港中文大學再生醫學教育部重點實驗室

第一作者：王鵬珍(1988-)，男，碩士，主要從事軟骨修復研究。

Icariin promote chondrocytes cultured on 3-D condition to generate new Cartilage in vitro

WANG Peng-Zhen, WAN Chao.

College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the mechanism of cartilage formation from chondrocytes treated by Icariin on 3-D condition in vitro.MethodsThe immature chondrocytes were divided into control and icariin concentration gradient groups. The most effective concentration of ICA was determined by MTT assay,Alcian blue staining and enzyme-linked immunosorbent assay, 10-6 mol/L ICA was determined as the most effective concentration and then used for subsequent experiments. Chondrocytes were seeded on Gelfoam? to form a complex block. The blocks were divided into control and ICA groups.ResultsICA significantly promoted the synthesis of collagen and proteoglycans of chondrocytes after being treated for 7 and 14 days. There were significant differences between ICA and control groups. Moreover, when the chondrocytes were cultured on Gelfoam?, ICA promoted chondrocyte special mark gene: aggrecan, collagen Ⅱ, HIF-1α and Sox9 to up-regulate in mRNA and protein levels. There were significant differences between ICA and control groups.ConclusionsIcariin could promote chondrocytes cultured on 3-D condition to generate new cartilage in vitro.

【Key words】Icariin;Chondrocyte;Collagen;Proteoglycan;Hydroxyproline

TGF-β具有抑制軟骨細胞分化、維持軟骨細胞表型的作用，為了抑制軟骨細胞過早分化為肥大軟骨細胞，從而影響骨骼縱向發育，TGF-β常被用于臨床治療〔1〕。但是，TGF-β的價格貴、易降解、易失效等特點常常限制其臨床使用。淫羊藿苷(ICA)對神經系統、內分泌系統、心血管系統和免疫系統等都能發揮藥理作用，尤其是ICA對軟骨發育方面的作用〔2〕。有報道證實，ICA對體外培養的兔軟骨細胞具有顯著促增殖作用，而且可以顯著促進軟骨細胞胞外基質的合成〔3，4〕。而且，ICA具有促進家兔軟骨下骨損傷修復的作用〔5〕。這種作用至少可歸因于ICA可以促進軟骨細胞特異基因的表達和軟骨胞外基質的分泌的能力。并且，這種作用已在家兔和大鼠體內得到實驗證實〔6，7〕。然而，其潛在的作用機制和信號通路還不清楚。本研究擬檢測ICA對胞外基質合成的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑ICA，批號:20090503，購于南京澤朗醫藥科技有限公司，HPLC 測定 ICA 含量不低于98%。DMEM培養基 (含10%小牛血清，100 U/ml青/鏈霉素和20 mmol/L L-谷氨酰胺)，DMEM誘導培養基 (含10%小牛血清，100 U/ml青/鏈霉素，20 mmol/L L-谷氨酰胺，0.05 mmol/L β-甘油磷酸鈉和0.1 mmol/L抗壞血酸)。Ⅰ型膠原酶，D型膠原酶，噻唑藍(MTT)，二甲亞砜(DMSO)。小鼠蛋白聚糖 (aggrecan)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(上海武昊，批號HZ-E14727)。小鼠羥脯氨酸 (hydroxyprolin) ELISA試劑盒 (武漢華美，批號CSB-E08839m)。抗兔 HRP/DAB(ABC)免疫試劑盒批號(abcam，ab 64261)。兔抗鼠Sox 9(sc-166505，Santa Cruz)，兔抗鼠HIF-1(NB100-105，NovusBio)。

1.2軟骨細胞的分離和培養軟骨組織取自新生2 d的小鼠，關節組織用0.7 mg/ml的膠原蛋白酶I 消化30 min，移入含0.7 mg/ml的膠原蛋白酶Ⅰ和3 mg/ml膠原蛋白酶D的PBS混合液中37℃消化6 h。用180 mm的濾膜過濾消化下來的軟骨細胞，離心后用PBS洗3次，將細胞重懸在DMEM中，之后在5% CO2，37℃條件下培養，每3 d換液1次。

1.3MTT檢測當第2代細胞長勢達到培養板面積80%～90%時，加入0.25%胰酶消化，用細胞計數器和臺盼藍染液確定細胞成活率>95%。細胞離心重懸后，種在96孔培養板。培養基中含ICA濃度依次為10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L；對照組不含ICA。每孔設置3個復孔。每孔細胞數為2×104，軟骨細胞在37℃、5% CO2培養箱培養。培養基每3 d 換液1次。分別在3、7和14 d后，每個孔加10 μl MTT，繼續培養4 h，直到終止培養。之后，移除培養基，每孔加入150 μl DMSO，96孔板在酶標儀570 nm測定吸光度A值。

1.4阿爾新藍染色將消化后的2代細胞重懸至密度為1×107個/ml，吸取10 μl接種到24孔板，小心滴在孔中間。3 h后，細胞貼壁，加入DMEM誘導培養基。隔天加入1 ml含ICA濃度依次為10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的DMEM誘導培養基，對照組加入不含ICA，其他條件完全相同的培養基。每3 d換液1次，分別經過7 d和14 d，棄掉培養基，用 PBS清洗1次，加入1 ml 10%甲醛固定20 min。之后用去離子水清洗3次，最后一次洗滌細胞微團15 min。每孔加入0.5 ml 1%阿爾新藍染液，室溫下染色1 h以上。棄掉染液，用70%乙醇洗滌2次，去離子水洗滌3次，晾干后，用掃描儀掃描圖片，記錄細胞染色區域與強度。用IPP6.0軟件測定圖片的平均光密度(IOD)，對染色強弱進行定量分析。

1.5ELISA測定aggrecan和hydroxyprolin濃度ICA處理7 d和14 d后，軟骨細胞用PBS洗3次，每孔細胞加入含 PMSF的RIPA溫和裂解液，冰上裂解30 min，收集到1.5 ml無菌離心管中。離心取上清液，按照小鼠蛋白聚糖酶聯免疫分析 (ELISA) 和小鼠羥脯氨酸ELISA試劑盒提供的步驟，450 nm波長處依序測量各孔的OD值，根據標準曲線，計算aggrecan的濃度，每孔的膠原蛋白的濃度用hydroxyprolin的量來表示。

1.6軟骨細胞和Gelfoam?復合塊構建無菌的Gelfoam?在超凈工作臺內紫外照射2 h。將 30 μl密度為 3×106個/ml細胞懸液沿各個面注入9 cm3的 Gelfoam?材料中。3 h后，細胞貼壁后形成復合塊。由前面MTT實驗、阿爾新藍染色結果和酶聯免疫分析可知，ICA為10-6mol/L時，最有利于軟骨細胞分泌胞外基質，因此用含 ICA 濃度為10-6mol/L的DMEM誘導培養基對Gelfoam?復合塊構建進行培養。正常誘導培養基培養作為對照組，每 2 d 換液1次。14 d后，收獲復合塊，分別用于后續的組織形態學，免疫組化分析和Real-time PCR分析。

1.7組織形態學和免疫組化分析Gelfoam?復合塊收獲后，用4%多聚甲醛固定，梯度蔗糖脫水，OCT包埋，液氮快速凝固，做成厚度為10 μm的冰凍切片，用于形態組織學分析，包括H&E染色、番紅O-固綠染色。免疫組化按HRP/DAB(ABC)免疫試劑盒說明操作。一抗:抗鼠 Sox9 (sc-166505，Santa Cruz)，稀釋比為1∶100，4℃過夜。抗鼠HIF-1(NB100-105，NovusBio)，稀釋比為1∶50，4℃過夜。IgG作為陰性對照。軟骨生成率表示為:紅色面積/總面積(%)。免疫組化半定量結果由本課題組不參與該實驗的其他成員來鑒定。具體方法:在顯微鏡下，隨機選擇組織切片的3個視野進行對陽性細胞和總細胞計數，即陽性表達率=陽性細胞/總細胞(%)。

1.8逆轉錄和Real-time PCR收集Gelfoam?復合塊，并用PBS清洗2遍，之后加入 Trizol提取mRNA。根據逆轉錄試劑盒(9068-38-6，promega)說明書，用 oligo-dT12-18 作為引物，用 MMLV反轉錄酶，將1 μg總RNA進行 cDNA第一鏈合成。Real-time PCR 用 CFX96TMReal-Time PCR檢測系統(Bio-Rad)檢測，使用SYBR Premix ExTaq (RR420A，Takara) 試劑盒，按照說明書要求進行操作。以2-△△t值作為基因mRNA擴增倍數來定量分析。以β-actin 作為內參。目的基因引物序列參見表1。

表1　目的基因引物序列

1.9統計學方法采用SPSS17.0統計軟件進行單尾ANOVA檢驗。

2結果

2.1MTTICA濃度為10-5mol/L時，ICA對軟骨細胞并沒有表現出促進增殖作用。ICA濃度為10-5mol/L時，3個時間段包括1 d(P<0.01)，2 d(P<0.01) 和3 d(P<0.01)，ICA都對軟骨細胞表現出明顯的增殖作用；與對照組相比，具有統計學差異。而ICA濃度為10-7mol/L對軟骨細胞表現出一定的促進增殖作用；但與對照組相比無統計學差異(P>0.05)。見圖1。

與對照組比較：1)P<0.01 圖1　不同濃度的ICA分別刺激軟骨細胞1、2和 3 d后吸光度值的大小

2.2阿爾新藍染色細胞培養7 d后，10-7mol/L (P<0.05)、10-6mol/L(P<0.01)和10-5mol/L(P<0.05)都明顯地促進軟骨細胞分泌aggrecan。細胞培養14 d后，10-7mol/L(P<0.05) ICA組、10-6mol/L(P<0.001) ICA組和10-5mol/L ICA(P<0.001)組，與對照組相比，aggrecan分泌量差異性均具有統計學意義。見圖2，表2。因此，ICA可以促進軟骨細胞分泌更多的aggrecan。考慮到ICA對軟骨細胞的最佳作用效果和成本，選用10-6mol/LICA用于后續軟骨細胞3-D培養實驗。

圖2　阿爾新藍染色

時間點對照組10-7mol/L10-6mol/L10-5mol/L7d0.16±0.010.42±0.191)0.57±0.012)0.47±0.011)14d0.19±0.010.53±0.321)1.10±0.233)0.64±0.063)

與對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01，3)P<0.001；下表同

2.3ELISA檢測結果ICA濃度為10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L都不同程度促進了aggrecan的表達。當10-6mol/L ICA處理細胞7 d后，aggrecan(P<0.01)的分泌量比對照組增加了1.1倍；而14 d后，aggrecan(P<0.001)的分泌量比對照組增加了2.1倍，與對照組相比，其表達量差異均具有統計學意義。hydroxyproline的表達量在一定程度上可以代表總膠原蛋白的表達量，所以可以用羥脯氨酸試劑盒檢測hydroxyproline的表達量〔8〕。hydroxyproline經過7 d(P<0.05) 和14 d(P<0.001)的處理后，在10-6mol/L ICA實驗組，hydroxyproline合成量明顯多于對照組，且其表達差異性具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3　不同濃度ICA對軟骨細胞分泌aggrecan和

2.4形態學分析和免疫組化與對照組相比較，ICA組的HE染色結果顯示，大部分細胞形成細胞簇，軟骨細胞分泌出更多的軟骨基質，將細胞連接為更致密的組織。番紅O-固綠染色主要用于檢測新的軟骨的形成，從圖3B和圖3D可以看出ICA組的新的軟骨的面積大于對照組，ICA組與對照組新形成軟骨的面積相對定量差異具有統計學意義(P<0.01)。免疫組化結果顯示，Sox9和HIF-1α 均表達于細胞核，而且相比對照組，ICA組Sox9和HIF-1α陽性細胞數目顯著性多于對照組。ICA 組的Sox9(P<0.01)和HIF-1α(P<0.01)表達率與對照組比具有統計學差異。這表明ICA可以促進Sox9和HIF-1α在核內的表達。見表4。

(A)對照組HE染色；(B)對照組番紅O-固綠染色；(C)ICA組HE染色；(D)ICA組番紅O-固綠染色；標尺：50 μm 圖3　Gelfoam ?復合塊HE、番紅O-固綠染色

(A)Sox9在對照組中的表達；(B)HIF-1α在對照組中的表達；(C)Sox9在ICA組的表達；(D)HIF-1α在ICA組表達；標尺：50 μm 圖4　Gelfoam ?復合塊免疫組化染色和Sox9和 HIF-1α陽性細胞數統計

2.5ICA對軟骨細胞特異基因表達的影響ICA刺激軟骨細胞 7 d時，collagen Ⅱ、Sox9和aggrecan表達量都有不同程度的上調，aggrecan mRNA(P<0.01)、collagen Ⅱ mRNA(P<0.01)、Sox9 mRNA (P<0.01)和HIF-1α mRNA (P<0.01)表達量顯著高于對照組。ICA刺激軟骨細胞14 d后，aggrecan mRNA(P<0.001)、collagen Ⅱ mRNA(P<0.001)、Sox9 mRNA(P<0.001) 和HIF-1α mRNA(P<0.01)的表達量顯著增加，與對照組相比，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見圖4，表5。

表4　各組軟骨生成率、Sox9和

表5　ICA處理軟骨細胞7 d 和14 d后,

3討論

本研究證實 ICA濃度為10-6mol/L時，對軟骨細胞起到顯著的增殖作用。通過阿爾新藍染色和酶聯免疫吸附檢測，發現aggrecan和hydroxyproline在 ICA濃度為10-6mol/L時，表達量最大。軟骨細胞胞外基質包括 collagen Ⅱ和aggrecan。Aggrecan形成的致密的網狀結構不僅能維持關節軟骨的結構完整性，而且還能發揮軟骨細胞的正常的生物學功能，如遷移能力、細胞黏附能力及細胞增殖和分化〔9，10〕。軟骨胞外基質甚至可以調控細胞分化與增殖，維持損傷組織的代謝與再生〔11〕。

本研究將細胞種在無菌的Gelfoam?材料上，模擬體內軟骨微環境。在此基礎上，進行免疫組化和形態組織學分析以及real-time PCR分析。結果顯示，在ICA作用下，軟骨細胞有助于向軟骨組織演進，以及aggrecan、collagen Ⅱ、HIF-1α 和Sox9 在蛋白水平和mRNA水平上表達上調。HIF-1α，對于哺乳動物，是一個低氧反應調節因子，介導低氧條件下軟骨特異基因的表達。HIF-1α蛋白的核內聚集會促使Sox9啟動子活性的增加，進而促進collagen Ⅱ和aggrecan mRNA的表達增加〔12〕。文獻報道，Sox9是早期軟骨發育的一個必不可少的轉錄因子，在Sox5和Sox6的輔助下，Sox9直接激活軟骨胞外特異基質基因〔13〕，包括 Sox9介導的collagen Ⅱ靶基因的表達。最新文獻中，免疫沉淀實驗證明HIF-1α和Sox9之間相互作用，而且 HIF-1α指導Sox9的活性〔14〕。本實驗也證實了HIF-1α和Sox 9之間的正相關關系，究其機制，可能是Gelfoam?這種材料，使細胞聚集成團，形成內部相對缺氧的三維立體環境。在這種條件下，ICA刺激低氧誘導因子HIFs 結合到乏氧反應元件(HRE)，激活其轉錄，從而誘發Sox9及其下游基因 aggrecan 和collagen Ⅱ的表達。而且Gelfoam?材料本身致密性的立體結構，有利于高密度的細胞黏附、增殖，以及細胞之間的信號傳遞，也可使細胞分泌的細胞外基質固守在細胞的附近，充分發揮細胞外基質對細胞增殖、分化及代謝的調節作用，為維系細胞的生長和代謝提供適宜的微環境。但Gelfoam?材料對軟骨細胞的作用如何，需要下一步將Gelfoam?材料作為單一影響因子進行研究。

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〔2015-04-30修回〕

(編輯曲莉)

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