丹參注射液對(duì)D－半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

丹參注射液對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

(重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究所，重慶400016)

摘要〔〕目的探討丹參對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其作用途徑。方法120 mg·kg-1·d-1D-半乳糖注射6 w建立衰老小鼠模型，第15天隨機(jī)分組后，丹參組注射丹參注射液0.1 ml/d連續(xù)28 d，空白對(duì)照和模型對(duì)照組注射等量的生理鹽水。水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；試劑盒測(cè)定血清和腦海馬組織超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、單胺氧化酶(MAO)活力及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，血清和海馬組織SOD、GSH-Px 活性下降，MDA含量增加MAO活性升高(P<0.05)；腹腔注射丹參后小鼠認(rèn)知記憶能力較模型組明顯改善，血清和海馬組織SOD、GSH-Px 活性明顯升高而MDA含量減少(P<0.05)，海馬中MAO活性降低 (P<0.05)。結(jié)論丹參注射液可改善D-半乳糖致衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制可能與改善血液和腦組織中SOD、GSH-Px 活力，降低血液和腦組織中MAO活性、 MDA含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕丹參；衰老；學(xué)習(xí)記憶

中圖分類號(hào)〔〕R961〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31100985)；重慶市科委自然科學(xué)基金(No.CSTC2010BB5096)

通訊作者：鄭敏(1972-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)研究。

第一作者：劉品月(1989-)，女，在讀碩士，主要從事神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)研究。

Effect of Danshen on learning and memory abilities in aged mice induced by D-galactose

LIU Pin-Yue,JIN Zhen-Chao,DENG Xiao-Lan,etal.

Department of Stem Cells and Tissue Engineering，Department of Histology and Embryology,Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Abstract【】ObjectiveTo study the effect of Salvia Miltiorrhiza(SM) on learning and memory ability of aging model mice induced by D-galactose.MethodsD-galactose was injected 120 mg·kg-1·d-1 for 42 days to make the aging model mice.15 d after,SM were injected(0.1 ml/d)to the SM group mice for 28 days.Water maze experiment was used to detect the abilities of learning and memory of mice;superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-Px),monoamine oxidase (MAO) activity and malondialdehyde (MDA) content in serum and brain tissue were checked.ResultsCompared with that of control group,learning and memory abilities of model group was decreased;the levels of SOD,GSH-Px activity in serum and hippocampus tissue were decreased while MAO activity and MDA content were increased(P<0.05).Injection of salvia miltiorrhiza obviously improved learning and memory abilities compared with those of model group;SOD,GSH-Px activity in serum and hippocampus were increased significantly and MDA content was decreased compared with those of model group(P<0.05),MAO activity in the hippocampus was also decreased(P<0.05).ConclusionsSalvia Miltiorrhiza could improve learning and memory abilities of D-galactose induced aging mice through improving SOD,GSH-Px vitality and reducing MAO activity and MDA content in the blood and brain tissue.

【Key words】Salvia Miltiorrhiza；Aging;Learning and memory

衰老是一種復(fù)雜的生命現(xiàn)象〔1〕。自由基學(xué)說認(rèn)為衰老與自由基酶活性降低，導(dǎo)致體內(nèi)氧化自由基增多有關(guān)。丹參及其提取物具有改善衰老動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶作用〔2,3〕。有文獻(xiàn)報(bào)道丹參對(duì)衰老小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有抑制作用〔4〕，而海馬與學(xué)習(xí)記憶能力有直接的聯(lián)系〔5〕。本研究觀察丹參注射液對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

因?yàn)橘愂陆M委會(huì)事先給出15個(gè)題庫，每個(gè)題庫有50道選擇題。教師只要把題庫按照職業(yè)基本素養(yǎng)和保育教育兩大類別進(jìn)行歸納整理，對(duì)選手概念模糊不清的題目進(jìn)行辨析，一般都可以得到較為理想的分?jǐn)?shù)，關(guān)鍵是理解記憶的問題。

1材料與方法

1.1材料動(dòng)物2～3月齡清潔級(jí)雄性昆明小鼠共24只，體重18～22 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。D-半乳糖購自Sigma公司；丹參注射液為正大青春寶產(chǎn)品，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z33020177；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)定量檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、單胺氧化酶(MAO) 活性檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；二喹啉甲酸法(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；水迷宮分析系統(tǒng)是成都泰盟有限公司產(chǎn)品。

1.2動(dòng)物分組、給藥與模型建立將雄性昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，丹參組，每組8只。室溫維持在20℃～25℃，自然照明，自由飲水和攝食。模型組和丹參組小鼠每天頸背部皮下注射D-半乳糖120 mg·kg-1·d-1，連續(xù)注射42 d；對(duì)照組注射等量的生理鹽水。從第15天開始丹參組每日腹腔注射丹參注射液0.1 ml，連續(xù)注射28 d，同時(shí)模型組和對(duì)照組注射等量的生理鹽水。

1.3學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試給藥結(jié)束后，采用改良的Morris 水迷宮方法〔6〕，測(cè)試過程中室溫保持在18℃～22℃。在槽壁上等距標(biāo)記A、B、C、D四個(gè)點(diǎn)作為固定入水點(diǎn)。槽中加入清水直至沒過平臺(tái)1 cm，水中加入墨水隱藏平臺(tái)。測(cè)試程序?yàn)槎ㄎ缓叫性囼?yàn)，訓(xùn)練時(shí)每天隨機(jī)將小鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄其尋找到并爬上隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，如果小鼠60 s以上未找到平臺(tái)，則潛伏期記為60 s，1次/d，共進(jìn)行8 d，作為判斷大鼠學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。

1.4血清中SOD、GSH-Px、MAO、 MDA的檢測(cè)測(cè)試結(jié)束后，眼眶取全血，促凝管收集，4℃離心3 000 r/min 離心10 min，吸取上清，測(cè)定上清液中SOD活性、GSH-Px、MAO活力及MDA含量。SOD測(cè)定采用水溶性四氮唑(WST)法，MDA測(cè)定采用TBA法，GSH-PX采用比色法，MAO采用紫外比色法，按試劑盒說明書操作。

1.5腦海馬組織中SOD、GSH-Px 、MAO、 MDA的檢測(cè)取血后斷頭處死，冰盤上迅速取下完整大腦，分離獲取海馬組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，稱重，用玻璃勻漿器在冰浴下加入蛋白裂解液研磨成100 g/L的腦組織勻漿液，4 000 r/min 4℃低溫離心10 min 吸取上清液，檢測(cè)方法同1.4。組織中蛋白含量的測(cè)定采用BCA法，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2結(jié)果

2.1丹參對(duì)衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與對(duì)照組相比，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；丹參組的逃避潛伏期明顯短于模型組(P<0.05)，對(duì)照組與丹參組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

2.2丹參對(duì)衰老模型小鼠血清SOD、GSH-Px、MAO、 MDA的影響模型組小鼠血清SOD、GSH-Px 活力下降，MDA含量增加(P<0.01)；丹參組與模型組比較小鼠血清SOD、GSH-Px升高，MDA含量下降(P<0.01)。見表2。

表1　丹參注射液對(duì)衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

與對(duì)照組比較：1)P<0.05;與模型組比較:2)P<0.05;下表同

表2　各組血清SOD、GSH-Px、MDA、MAO 的改變

2.3丹參對(duì)衰老模型小鼠海馬組織中SOD、GSH-Px、 MDA、MAO含量的影響模型組小鼠海馬組織SOD、GSH-Px 活力下降，MAO活性增加，MDA含量增加(P<0.05)；丹參組與模型組比較小鼠海馬組織SOD、GSH-Px 升高，MDA，MAO含量下降(P<0.05)。見表3。

表3　各組海馬SOD、GSH-Px、MDA、MAO 的改變

3討論

衰老，通常是指在正常狀況下生物體發(fā)育成熟后，隨年齡增加，自身功能減退，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降，從而導(dǎo)致組織器官結(jié)構(gòu)、功能衰退的不可逆的生理過程。自由基學(xué)說是目前公認(rèn)的衰老機(jī)制之一。該學(xué)說認(rèn)為機(jī)體在代謝過程中產(chǎn)生自由基，其具有極強(qiáng)的氧化能力導(dǎo)致生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的改變，但同時(shí)機(jī)體又具有有效的自由基清除系統(tǒng)(如SOD等)，使體內(nèi)自由基維持在正常水平。衰老時(shí)這一平衡逐漸被破壞，造成自由基過剩進(jìn)而導(dǎo)致生物體整體的機(jī)能減退〔7〕。在衰老的過程中，神經(jīng)系統(tǒng)的衰退尤為重要，突出表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知能力的減退。

丹參是一種中華醫(yī)學(xué)的傳統(tǒng)藥物，具有活血化瘀、清心安神的功效，目前認(rèn)為丹參及其提取物具有抗脂質(zhì)過氧化，提高SOD從而保護(hù)組織細(xì)胞免遭自由基的損傷的作用，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞模型結(jié)構(gòu)有一定保護(hù)作用〔8〕。本研究認(rèn)為丹參可能通過抑制自由基反應(yīng)，從而改善衰老動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力。

D-半乳糖致衰老小鼠模型是國際上認(rèn)可的衰老模型。該模型小鼠表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能障礙、免疫功能低下等一系列自然衰老的現(xiàn)象，是進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能、衰老等研究的良好模型。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)用于測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置感和方向感(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力，被廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶、老年癡呆、智力與衰老、新藥開發(fā)、篩選、評(píng)價(jià)等多個(gè)學(xué)科的科學(xué)研究。本文通過D-半乳糖建立的小鼠衰老模型在水迷宮實(shí)驗(yàn)中明顯表現(xiàn)出腦衰老的癥狀，學(xué)習(xí)記憶能力下降，而經(jīng)過丹參注射液作用28 d后，衰老小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，小鼠的認(rèn)知記憶能力得到改善。

SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，對(duì)維持機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，能清除超氧陰離子自由基(O2-)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。MAO為催化單胺氧化脫氨反應(yīng)的酶，具有調(diào)節(jié)生物體內(nèi)胺濃度的功能，MAO活性的升高會(huì)引起整個(gè)機(jī)體器官功能尤其是腦功能的逐步退化、衰老。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物，對(duì)MDA含量的檢測(cè)可反映出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從自由基角度證實(shí)了自由基在衰老中的作用。丹參注射液治療后衰老小鼠血清和腦海馬組織中具有抗自由基作用的SOD和GSH-Px的活性顯著增加，而MAO活性和MDA含量明顯降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示丹參注射液具有提高衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、延緩衰老的作用，為丹參在抗衰老方面的應(yīng)用提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。丹參抗衰老機(jī)制很可能與其提高機(jī)體抗氧化能力、清除自由基維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡有關(guān)，但是丹參如何改變SOD和GSH-Px活性、降低MAO活性和MAD含量的作用機(jī)制尚不明確；此外，本實(shí)驗(yàn)采用的丹參注射液為中藥復(fù)方制劑，其有效成分包括水溶性丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B等〔9〕，哪種成分在抗衰老中起關(guān)鍵作用，有待進(jìn)一步研究。

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〔2014-10-25修回〕

(編輯袁左鳴)