益氣化瘀化痰養陰劑對肝纖維化模型大鼠肝臟上皮間質表型的影響

益氣化瘀化痰養陰劑對肝纖維化模型大鼠肝臟上皮間質表型的影響

高世嬌陳文龍何英曹文富賴國旗1

(重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶400016)

摘要〔〕目的探討益氣化瘀化痰養陰劑對肝纖維化大鼠肝臟上皮間質表型的影響。方法將30只SD大鼠隨機分為益氣化瘀化痰養陰劑組、肝纖維化模型組和正常對照組，益氣化瘀化痰養陰劑組及肝纖維化模型組用CCl4和高脂低蛋白飲食建立肝纖維化大鼠模型，益氣化瘀化痰養陰劑組每日用益氣化瘀化痰養陰劑灌胃，肝纖維化模型組和正常對照組則用等體積生理鹽水。12 w后，采用Masson染色及電鏡觀察大鼠肝臟纖維化程度。采用熒光定量PCR檢測大鼠肝臟FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad mRNA的表達，采用Western印跡法檢測大鼠肝臟成纖維細胞特異蛋白(FSP1)、轉化生長因子(TGF)-β1、α-平滑肌肌動蛋白(SMA)及E-鈣黏附蛋白(cad)蛋白的表達。結果與模型組相比，益氣化瘀化痰養陰劑組肝組織Masson染色及電鏡下均可見纖維化程度明顯改善；益氣化瘀化痰養陰劑組FSP1、TGF-β1、α-SMA mRNA及蛋白的表達較模型組明顯降低(P<0.05)，而E-cad mRNA及蛋白的表達較模型組明顯升高(P<0.05)。結論益氣化瘀化痰養陰劑對大鼠肝纖維化具有一定干預作用，該作用可能與其抑制肝組織上皮間質轉化的發生有關。

關鍵詞〔〕肝纖維化；益氣化瘀化痰養陰劑；上皮間質轉化

中圖分類號〔〕R563〔

基金項目：國家自然科學基金預研項目(No.NSFYY-201108)

通訊作者：何英(1962-)，女，副教授，主要從事老年病學及風濕免疫病學研究。

1重慶醫科大學實驗動物中心

第一作者：高世嬌(1988-)，女，碩士，主要從事老年病學及風濕免疫病學研究。

Effects of Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation on epithelial mesenchymal transition in rats of liver fibrosis

GAO Shi-Jiao,CHEN Wen-Long,HE Ying,etal.

Department of Integrative Chinese and Western Medicine,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation on the liver histopathology and expression of epithelial mesenchymal transition (EMT) in liver fibrosis rats induced by CCl4.MethodsThe models of liver fibrosis were established with the methods of carbon tetrachloride and high fat,low protein diet.The successfully established SD rats were randomly divided into normal,model and Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation groups.The pathological changes of the liver tissue were observed by both light and electron microscopy.The expressions of FSP1,E-cad,α-SMA,TGF-β1 mRNA and protein in the liver tissue were detected by qRT-PCR and Western blot.ResultsCompared with that of model group,the degree of fibrosis in Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation group was decreased effectively,the FSP1,α-SMA and TGF-β1 mRNA and protein expressions were significantly lower in liver tissue(P<0.01).The E-cad mRNA and protein expressions were increased obviously in liver tissue(P<0.01).ConclusionsThe Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation might restrain the development of liver fibrosis by regulating the mRNA and protein expressions of EMT.

【Key words】Liver fibrosis；Yiqi-Huayu-Huatan-Yangyin preparation；EMT

肝纖維化是多種慢性肝病發生發展的共同病理階段，經典觀點認為肝纖維化是由于肝內結締組織異常增生、細胞外基質(ECM)的過度沉積及降解失衡所致。但近年來越來越多的研究表明，ECM并非唯一參與肝纖維化的因素，肝上皮細胞可通過上皮間質轉化(EMT)獲得遷移及表達纖維細胞經典標志物的能力，密切參與肝纖維化的形成〔1～6〕。本課題組前期研究〔3〕提示，益氣化瘀化痰養陰合劑抑制大鼠肝纖維化作用優于益氣、化瘀、化痰、養陰劑各劑單用，但其具體機制尚不十分清楚。本實驗擬在前期實驗基礎上，觀察大鼠肝臟中EMT相關的基因成纖維細胞特異蛋白(FSP1)、轉化生長因子(TGF-β1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及鈣黏附蛋白(E-cad)的表達，進一步探討益氣化瘀化痰養陰劑對肝纖維化中EMT發生的影響。

1材料與方法

1.1材料SPF級雄性SD大鼠30只，體重180～220 g，飼養于重慶醫科大學實驗動物中心，許可證號：〔SYXK(渝)2007-0001〕。選用黃芪、白術、川芎、姜黃、半夏、海藻、白芍、鱉甲(購自重慶桐君閣藥房)按1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶2比例配伍〔3〕，常規水煎，并濃縮成益氣化瘀化痰養陰口服制劑(簡稱益氣化瘀化痰養陰劑)，每1 ml含生藥2 g。CCl4(分析純，Sigma，美國)；Trizol(碧云天公司，中國)；逆轉錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒(TaKaRa公司，中國)；兔抗FSP1、兔抗E-cad、兔抗α-SMA、兔抗TGF-β1(Abcam公司，美國)；其他常規試劑均為國產分析純。

1.2造模及分組將30只雄性SD大鼠隨機分為對照組8只，模型組22只；正常對照組予以普通飼料喂養，模型組大鼠予以：(1)高脂低蛋白飼料(39.5%玉米面+40%面粉+20%豬油+0.5%膽固醇)；(2)背部皮下注射40%CCl4油劑，首次注射劑量為0.5 ml/100 g體重，以后2次/w，每次注射劑量0.3 ml/100 g體重；(3)以5%酒精為唯一飲料，建立肝纖維化大鼠模型，造模過程中肝纖維化模型組死亡4只大鼠。12 w后隨機選取2只大鼠處死，取肝組織行Masson染色方法觀察，確定肝纖維化模型復制成功，隨機分為肝纖維化模型組8只，益氣化瘀化痰養陰劑組8只。

1.3給藥方法正常對照組、肝纖維化模型組大鼠均以生理鹽水灌胃(1 ml·100 g-1·d-1)，益氣化瘀化痰養陰劑組以2 g生藥/100 g體重中藥制劑灌胃，1次/d，連續觀察12 w。

1.4標本采集實驗結束后，用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，斷頭處死大鼠，取部分肝組織用4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，用于Masson膠原三色染色；另取部分肝組織于液氮中冷凍后，轉移到-70℃冰箱保存，用于qRT-PCR及Western印跡檢測。

1.5形態學觀測將肝組織行石蠟切片固定，Masson染色，光鏡下觀察肝臟病變；電鏡下觀察肝臟的超微結構改變及膠原纖維沉積的情況。

1.6FSP1、TGF-β1、α-SMA、E-cad mRNA表達的qRT-PCR檢測按Trizol說明書提取大鼠肝臟組織總RNA，用紫外分光光度計測定RNA濃度，純度A260/A280在1.8～2.0。按RT-PCR試劑盒說明書取1 μg總RNA逆轉錄為cDNA。最后以SyBR green作為熒光標記物，進行熒光定量PCR，反應條件：預變性95℃ 3 min，變性95℃ 5 s，退火59℃ 30 s，延伸65℃ 5 s，共40個循環。由上海生工公司設計、合成大鼠FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad的引物。見表1。用CFX Manager Software采集數據，使用目的基因與內參基因的平均ΔCt，采用相對定量法(2- ΔΔCt)法處理得到的數據。

1.7FSP1、TGF-β1、α-SMA、E-cad 蛋白表達的Western印跡檢測稱取100 mg肝組織于1 ml組織裂解液中冰浴勻漿30 min，4℃離心后取上清，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白量，30 g蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，將目的蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，Tris鹽酸緩沖液(TBS)漂洗，加入一抗，4℃孵育過夜。TBS洗膜3次后，加入辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育2 h，洗脫二抗，化學發光檢測各組蛋白的表達。應用Bandscan 5.0圖像分析軟件，定量分析根據目的條帶的積分光密度與內參β-actin 密度之比進行。

表1　qRT-PCR 引物序列

2結果

2.1一般情況正常對照組大鼠在實驗期間飲食良好，毛發潤澤、緊密，活動靈敏，且體重增加明顯；肝纖維化模型組大鼠進食減少，毛發暗沉發黃、稀疏，精神差，活動減少，且體重增加緩慢；益氣化瘀化痰養陰劑組大鼠一般情況較模型組明顯好轉，活動趨于正常。

2.2肝組織病理形態學觀察

2.2.1Masson三原染色正常對照組大鼠肝小葉結構完整，肝索排列整齊，細胞無脂肪變及壞死；肝纖維化模型組大鼠肝小葉結構破壞，肝細胞彌漫性脂肪變，膠原纖維沉積，肝纖維化程度明顯；益氣化瘀化痰養陰劑組大鼠肝小葉結構基本恢復正常，肝組織膠原纖維積聚明顯減少，肝纖維化程度明顯減輕。見圖1。采用METAVIR評分系統將肝纖維化程度分為4級，各組之間纖維化程度差異具有顯著差異(F=49.349，P=0.00)。肝纖維化模型組與正常對照組以及益氣化瘀化痰養陰劑組與肝纖維化模型組相比，纖維化程度均有顯著差異(P<0.05)。見表2。

2.2.2電鏡結果正常對照組大鼠肝組織電鏡下結構正常，無明顯膠原纖維沉積；模型組可見內皮細胞腫脹，血竇內微絨毛腫脹、變性，膽小管擴張，大量膠原纖維沉積；益氣化瘀化痰養陰劑組可見肝細胞基本正常，血竇內微絨毛無明顯改變，未見明顯膠原纖維沉積。見圖2。

圖2　益氣化瘀化痰養陰劑對肝纖維化大鼠肝組織的電鏡影響

組別nMETAVIR評分(n)0級1級2級3級4級平均Ridit值正常對照組8800000.240肝纖維化模型組8001610.7821)益氣化瘀化痰養陰劑組8431000.4021)2)合計241232610.4751)

與正常對照組比較：1)P<0.05；與肝纖維化模型組比較：2)P<0.05，下表同

2.3大鼠肝組織中FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad mRNA的表達與正常對照組相比，肝纖維化模型組大鼠肝臟FSP1、TGF-β1及 α-SMA mRNA表達顯著增強(P<0.05)，E-cad mRNA表達顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，益氣化瘀化痰養陰劑組大鼠肝組織FSP1、TGF-β1及α-SMA mRNA表達明顯降低(P<0.05)；E-cad mRNA表達明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3　各組大鼠肝臟FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad mRNA

2.4大鼠肝組織中FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad蛋白質的表達與正常對照組相比，肝纖維化模型組大鼠肝臟FSP1、TGF-β1及α-SMA 蛋白表達明顯增強(P<0.05)，E-cad 蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，益氣化瘀化痰養陰劑組大鼠肝組織FSP1、TGF-β1及α-SMA 蛋白表達顯著降低(P<0.05)；而E-cad 蛋白表達顯著增強(P<0.05)，其中，FSP1、TGF-β1、α-SMA及E-cad 與正常對照組相比差異無統計學意義。見圖3，表4。

1：正常對照組；2：肝纖維化模型組；3：益氣化瘀化痰養陰劑組 圖3　益氣化瘀化痰養陰劑對肝纖維化大鼠FSP1、TGF-β1、 α-SMA及E-cad蛋白表達的影響

組別FSP1TGF-β1α-SMAE-cad正常對照組0.31±0.060.37±0.060.58±0.060.82±0.06肝纖維化模型組0.77±0.071)0.96±0.051)0.97±0.061)0.56±0.051)益氣化瘀化痰養陰劑組0.46±0.072)0.49±0.042)0.71±0.052)0.73±0.072)

3討論

EMT是指上皮細胞失去原有的極性和緊密黏附，鈣黏附蛋白表達受到抑制、細胞獲得移動性。Zeisberg等〔7〕用FSP1作為上皮間質轉化的成纖維細胞標志物，證實了肝纖維化中FSP1的表達及遷移，隨后他們進一步使用遺傳系譜標記技術，利用雙轉基因小鼠對肝細胞進行追蹤，證明了體內肝細胞發生了EMT，參與肝纖維化的形成。EMT涉及的信號通路較多，主要有TGF-β1通路、酪氨酸激酶受體通路及Wnt通路等。其中TGF-β1通路是作用較為明確的通路之一。TGF-β1通過調控下游信號通路smad通路〔6〕，明顯促進肝細胞發生EMT，上皮細胞極性消失，間質細胞表達上調，α-SMA、波形蛋白等蛋白表達〔8〕，膠原合成增加，從而促進肝纖維化形成。同時，smad2/3復合體的活化可激活鋅指轉錄因子家族中的snail-1蛋白〔7〕，后者可識別并與E-cad啟動子部位結合，抑制E-cad的轉錄，從而降低細胞內E-cad的水平〔1〕。本實驗證實了肝纖維化大鼠肝組織中EMT的發生。

現代中醫學認為，肝纖維化屬于“血瘀”、“積證”、“脅痛”等病證范疇，其基本證型為氣陰虛損、瘀血阻絡〔9〕，因此，目前多用活血化瘀、益氣養陰為治則治療肝纖維化。有研究表明，益氣活血藥黃芪、白術、川芎及姜黃能有效減少肝纖維化大鼠肝組織中炎癥因子表達、抑制膠原合成〔10〕；化瘀化痰藥半夏、海藻軟堅散結，阻止慢性肝損傷向肝纖維化及肝硬化發展；養陰柔肝藥白芍、鱉甲可通過減少細胞外基質異常沉積等抑制肝纖維化〔11，12〕。目前實驗研究大多只選取益氣活血、化瘀化痰或養陰柔肝其中一類藥物，而本課題組選用的益氣化瘀化痰養陰劑，兼顧三者功效，從多角度抑制肝纖維化的發展。

4參考文獻

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〔2014-02-11修回〕

(編輯袁左鳴)