電針對部分雄激素缺乏綜合征大鼠睪丸P450scc/SF－1表達的影響

電針對部分雄激素缺乏綜合征大鼠睪丸P450scc/SF-1表達的影響

任毅1楊曉光1李學智1張愉2汪瑩1傅艷3

(重慶醫科大學中醫藥學院，重慶400016)

摘要〔〕目的觀察中老年部分雄激素缺乏綜合征(PADAM)大鼠睪丸細胞色素P450側鏈裂解酶(P450scc)和類固醇生長因子-1(SF-1)的表達及電針干預對其表達的影響，探討P450scc和SF-1在電針調節睪酮分泌過程中的作用。方法將40只雄性SD大鼠分為正常組(n=10)和造模組(n=30)，造模組腹腔注射環磷酰胺復制PADAM模型。從造模成功的大鼠中隨機選取20只分為電針組(n=10)和模型組(n=10)。電針組取“腎俞”“關元”針灸，留針15 min，每日治療1次。在第8周用ELISA分別檢測正常組、電針組和模型組大鼠血清的總睪酮(TT)、游離睪酮(FT)水平；免疫組織化學法檢測P450scc蛋白表達；Western印跡檢測SF-1蛋白表達；RT-PCR檢測P450scc和SF-1mRNA的表達。結果治療8 w時，ELISA結果顯示，電針組血清TT、FT水平明顯高于模型組(P<0.01)；電鏡結果顯示，電針組Leydig細胞正常，線粒體和內質網含量較模型組多；HE染色結果顯示，電針組睪丸組織中曲細精管管腔腫脹程度較模型組減輕，Sertoli細胞較模型組排列整齊；免疫組化和WB結果顯示電針組P450scc和SF-1蛋白表達較模型組升高(P<0.01)；RT-PCR結果顯示，電針組P450scc和SF-1mRNA表達較模型組升高(P<0.01)，且兩者具有相關性(|r|≥0.8，P<0.01)。結論電針能明顯升高PADAM大鼠體內睪酮水平，改善睪丸Leydig細胞和Sertoli細胞病理表現。電針干預后可提高P450scc和SF-1的表達，這可能是電針治療PADAM的作用機制之一。

關鍵詞〔〕部分雄激素缺乏綜合征；電針；細胞色素P450側鏈裂解酶；類固醇生長因子-1

中圖分類號〔〕R245.3；R245.8〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81303036)；重慶醫科大學基金(No.XBYB2008090)

通訊作者：李學智(1973-)，女，副教授，碩士生導師，主要從事針灸治病的中樞神經信息調控基礎研究。

1重慶醫科大學中醫藥研究室

2重慶醫科大學生物醫學工程學院省部共建國家重點實驗室培育基地——重慶市超聲醫學工程重點實驗室重慶市生物醫學工程學重點實驗室

3重慶醫科大學實驗教學管理中心

第一作者：任毅(1988-)，男，碩士，主要從事針灸防治疾病的機制研究。

Effect of electroacupuncture on the expression of cytochrome P450 side chain cleavage and steroidogenic factor 1 in rats with partial androgen deficiency

REN Yi,YANG Xiao-Guang,LI Xue-Zhi,etal.

College of Traditional Chinese Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture (EA) intervention on expression of cytochrome P450 side chain cleavage (P450scc) and steroidogenic factor(SF)-1 in the testis of partial androgen deficiency of aging male (PADAM) rats so as to study its mechanism to improve testosterone.MethodsA total of 40 male Sprague Dawley rats were randomly divided into control(n=10) and building model groups(n=30),and building model group' rats were injected in abdominal cavities with cyclophosphamide to make PADAM model.PADAM model rats were randomized into EA and model groups.The serum TT and FT levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The expression levels of P450scc and SF-1 proteins and mRNA in testis were assayed by immunohistochemistry,Western blot and RT-PCR.ResultsAfter 8 weeks,the serum TT,FT levels in EA group were significantly higher than those in model group(P<0.01).The expression levels of P450scc and SF-1 proteins and mRNA in EA group were significantly higher than those in model group(P<0.01).ConclusionsEA is an effective method to improve serum TT,FT levels of PADAM rats.It also could significantly improve testicular P450scc and SF-1 proteins and mRNA,which might be one of the mechanisms of EA therapy for PADAM.

【Key words】PADAM;Electroacupuncture;Cytochrome P450 side chain cleavage; Steroidogenic factor(SF)-1

電針對提高中老年男性部分雄激素缺乏綜合征(PADAM)患者雄激素水平有確切臨床療效〔1～3〕。本實驗擬觀察電針對睪丸Leydig細胞P450scc和SF-1表達的影響，探討電針對雄激素水平的調節與P450scc及SF-1的關聯性。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組2月齡、同批次SD雄性大鼠40只，SPF級，體質量180～220 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供〔質量合格證：0002541；生產許可證：SYXK(渝)2012-0001〕。隨機分為2組：正常組(n=10)和造模組(n=30)。所有大鼠在相同條件(溫度20℃～24℃，濕度40%～50%，12 h光暗周期)下飼養1 w。實驗過程中對大鼠的處置符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2主要試劑和儀器P450scc和SF-1抗體(美國Santa Cruz公司)；HRP標記的二抗(北京康為生物試劑公司)；Taq DNA聚合酶(美國ProbeGnen公司)；總RNA提取和逆轉錄試劑盒(美國Promega公司)；SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色劑(美國Sigma公司)；總睪酮(TT)和游離睪酮(FT)試劑盒(上海滬尚生物科技有限公司)；環磷酰胺注射粉針(0.2g/支，批號H14023686，山西普德藥業股份有限公司)。石蠟切片機(Leica SM2000R，德國)；生物顯微鏡(iMark-14047，上海)；透射電鏡(H-7500，日本)；凝膠成像系統(Gel Doc2000，美國)。韓氏電針治療儀(北京)；針灸針(32號1寸，華佗牌)。

1.3PADAM大鼠模型制備及評價標準參考何清湖等〔4〕的方法，造模組腹腔注射環磷酰胺20 mg·kg-1·d-1，連續5 d，復制PADAM大鼠模型，正常組腹腔注射等量生理鹽水。參考孫祥宙等〔5〕的評價標準，統計得出正常組大鼠血清TT、FT水平的95%置信區間，造模組大鼠造模后血清TT和FT同時低于各自區間為造模成功，可用于實驗。

1.4電刺激方法造模成功大鼠隨機選取20只分為電針組(n=10)和模型組(n=10)。根據文獻〔6〕所載行穴位定位。選取“腎俞”(BL23)和“關元”(CV4)穴，采用HANS電針儀，刺激參數為連續波，頻率20～30 Hz，強度以保持針柄輕微顫動為度(電流強度1～3 mA，電壓1～3 V)，留針15 min，連續治療8 w。正常組、模型組大鼠的固定方式和時間與電針組一致。

1.5行為學檢測各組大鼠在治療前后，參考Steru等〔7〕方法，以懸尾時間判斷大鼠肌力以及抑郁狀態；參考Mcardle等〔8〕的方法，以強迫游泳時間判斷大鼠的體力并衡量是否疲勞。

1.6ELISA檢測血清睪酮水平各組大鼠在治療前后分別內眥取血2 ml，立即離心，取上清液，檢測血清TT、FT水平。

1.7透射電鏡檢測各組大鼠在治療后經10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)深度麻醉，迅速打開陰囊，分離睪丸和附睪。右側睪丸立即放入液氮保存備用，避免反復凍融。左側睪丸用2.5%戊二醛原位固定0.5 h，取部分組織切成3塊1 mm×1 mm×1 mm的立方體，迅速重新置入2.5%戊二醛保存。標本送往重慶醫科大學生命科學院電鏡室進行切片、鉛鈾雙重染色，H-7500型透射電鏡下觀察。

1.8HE染色左側睪丸取部分組織按上述方法制作成電鏡標本，剩余組織置于4%多聚甲醛固定24 h，進行常規脫水、透明、石蠟包埋、連續冠狀面切片，切片厚度4 μm，進行HE染色。置于100倍光鏡下觀察。

1.9SABC免疫組化染色檢測P450scc蛋白表達取按上述方法制作的石蠟切片，滴加3%H2O2室溫封閉10 min，微波高溫修復抗原后冷卻至室溫；用山羊血清封閉15 min后去掉封閉液；滴加P450scc抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜；加二抗37℃孵育20 min；滴加SABC試劑，37℃孵育20 min；滴加DAB顯色，蘇木精復染，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，雙蒸水沖洗，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂封固，置于400倍光鏡下觀察，棕黃色顆粒為免疫反應陽性產物。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析陽性產物平均光密度。

1.10Western印跡檢測SF-1蛋白表達取上述液氮保存的睪丸約40 mg，采用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。每孔上樣量50 μg，進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉4 h，加SF-1抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，37℃復溫30 min；加HRP標記的二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h。以GAPDH為內參，凝膠成像系統成像，用Quantity One 4.6圖像分析軟件進行結果分析。

1.11RT-PCR檢測P450scc和SF-1 mRNA的表達取上述液氮冷凍保存的睪丸約100 mg，嚴格按照RNA提取試劑盒說明書要求提取睪丸組織的總RNA；取2 μg總RNA為模板，按照RNA逆轉錄試劑盒說明書要求合成cDNA。P450scc引物：正義序列5’-CGCTCAGTGCTGGTCAAA-3’，反義序列5’-TCTGGTAGACGGCGTCGA-3’，擴增片段688 bp；SF-1引物：正義序列5’-TGCTCCAGTTGCATGCACCTG-3’，反義序列5’-GTTGGAAGAGTAACTCTACG-3’，擴增產物305 bp；β-actin(作為內參)引物序列：正義5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，反義5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，擴增片段868 bp；引物均由重慶海韻生物技術有限公司合成。取1 μl cDNA為模板，在Taq DNA聚合酶催化下進行PCR擴增，利用凝膠成像系統對結果進行分析。

1.12統計學分析采用SPSS19.0軟件行配對t檢驗、單因素方差分析及LSD法。

2結果

2.1各組大鼠治療前后一般情況比較正常大鼠血清TT、FT的95%置信區間分別為5.56～5.60 ng/ml和4.71～4.81 nmol/L，造模組腹腔注射環磷酰胺之后，血清TT、FT均小于該區間值，表明全部造模成功。與治療前相比，治療后電針組大鼠血清TT、FT水平及強迫游泳時間明顯高于模型組，而懸尾時間較模型組低(P<0.01)。電針組和正常組之間無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠治療前后一般情況比較 ± s)

與正常組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

2.2透射電鏡觀察各組大鼠Leydig細胞組織結構正常組Leydig細胞形態規則，線粒體及內質網豐富。模型組曲細精管管腔明顯腫脹，Leydig細胞擠壓變形，內質網嚴重破壞以致鏡下不可見，線粒體含量較正常組明顯減少。電針組較模型組形態規則，線粒體及內質網含量更豐富，與正常組比較無明顯差異。見圖1。

2.3HE染色觀察各組大鼠睪丸病理學改變正常組睪丸曲細精管管腔規則，基膜完整，睪丸Sertoli細胞排列整齊。模型組曲細精管管腔出現不同程度的腫脹，Sertoli細胞脫落缺失。電針組較模型組有明顯的改善，可見管腔腫脹程度減輕，管腔規則且基膜完整，Sertoli細胞較模型組排列整齊。見圖2。

圖1　各組大鼠Leydig細胞組織結構變化

圖2　各組大鼠曲細精管及Sertoli病理學變化(×100)

2.4免疫組化檢測各組大鼠睪丸P450scc蛋白的表達三組大鼠Leydig細胞內均有P450scc的免疫反應陽性表達，主要集中在細胞胞質中，顯示為粗細不等的棕黃色顆粒(見圖3)。正常組(0.37±0.046)和電針組(0.36±0.031)的P450scc蛋白表達顯著高于模型組(0.25±0.036)(P<0.01)，而正常組與電針組的表達無統計學差異(P>0.05)，見圖3。

圖3　免疫組化檢測各組大鼠睪丸P450scc的蛋白表達(×400)

2.5Western印跡檢測各組大鼠睪丸SF-1蛋白的表達正常組(0.038±0.007 2)與電針組(0.039±0.005 6)的SF-1蛋白表達明顯高于模型組(0.022±0.004 6)(P<0.01)；電針組的SF-1蛋白表達與正常組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4　Western印跡檢測各組大鼠睪丸SF-1的蛋白表達

2.6RT-PCR檢測各組大鼠睪丸P450scc和SF-1 mRNA的表達正常組與電針組的P450scc和SF-1 mRNA表達明顯高于模型組(P<0.01)；電針組與正常組表達無統計學差異(P>0.05)。Pearson相關性分析發現，正常組與模型組二者具有高度相關性(|r|≥0.8，P<0.01)，而電針組與模型組存在顯著相關性(|r|>0.95，P<0.01)。見圖5，表2。

圖5　各組大鼠睪丸P450scc和SF-1 mRNA表達

組別P450sccmRNASF-1mRNAPearson相關性分析正常組0.87±0.0371)0.031±0.00391)r=0.851,P=0.002電針組0.86±0.0391)0.028±0.00411)r=0.966,P=0.000模型組0.25±0.0380.016±0.0037r=0.947,P=0.000

與模型組比較：1)P<0.01

3討論

我國PADAM發病率40歲以上為13%，50歲以上為30%，70歲以上達47%〔9〕，已嚴重影響中老年男性的身心健康。

現代研究表明針灸抗衰老的原理是使低表達的基因水平上調，使異常高表達的基因水平下調，從而對衰老機體紊亂的分子網路發揮整體的調節作用，促使基因表達恢復協調，延緩衰老進程〔10〕。中醫認為人的生長、發育及衰老與腎臟關系最為密切，腎中所寓元氣是人身生命機能的原動力，腎精充足、腎氣旺盛才能筋強骨壯、髓海充足、延緩衰老。“腎俞”出自《靈樞·背俞》，為腎中精氣輸注之處；“關元”出自《靈樞·寒熱病》，為人身元陰元陽關藏之處；二穴相配，可補益腎精、溫壯元氣、燮理陰陽，發揮對老年男性的保健和相關疾病的治療作用。

睪酮水平下降主要原因是下丘腦-垂體-睪丸軸(HPTA)功能減退，Leydig細胞合成睪酮的能力降低〔11～13〕，而Leydig細胞合成睪酮則需要限速酶進行一系列的酶促反應；同時，睪酮作為一種類固醇激素，其合成也需要類固醇生長因子的正向調節。

P450scc是催化所有類固醇激素合成第一步反應的關鍵酶，而此反應也是類固醇激素合成的主要限速位點。睪丸中P450scc則只定位于Leydig細胞〔14〕。P450scc位于Leydig細胞線粒體內膜，一方面P450scc作為載體，轉運睪酮合成原料膽固醇到線粒體內膜，另一方面P450scc催化同一位點的三個連續氧化反應，第一步使膽固醇C22羥化；第二步使C20羥化，生成C20～22羥化膽固醇；第三步在C22和C20之間裂解，生成孕烯醇酮和乙內酰胺，而孕烯醇酮再經一系列的酶促反應最終轉變為睪酮〔9〕。本實驗結果顯示，電針可能是通過調節P450scc在睪丸中的表達從而促進睪酮的合成與分泌。

SF-1屬于核激素受體超家族，是參與類固醇合成酶及蛋白基因調節的最重要的轉錄因子〔15〕。本實驗結果顯示，電針通過調節睪丸SF-1的表達，從而激發CYP11A1在Leydig細胞內的轉錄，使P450scc蛋白含量增加，最終促進睪酮的合成與分泌。

目前，電針對雄激素分泌調節方面的研究轉變〔16，17〕，但對Leydig細胞中睪酮合成酶及蛋白表達調控因子方面的研究甚少，本實驗結果表明電針可以明顯提高PADAM大鼠睪丸SF-1水平，增加P450scc基因的轉錄和蛋白的表達，最終促進睪酮的合成與分泌，這可能是電針促進睪酮分泌的機制之一。

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〔2014-09-25修回〕

(編輯郭菁)