老年SD大鼠脾臟和外周血T淋巴細胞亞群的變化

老年SD大鼠脾臟和外周血T淋巴細胞亞群的變化

張江蘭李蕓吉靈改任君旭張耕吳靖芳

(河北北方學院，河北張家口075000)

摘要〔〕目的探討 SD老年大鼠脾臟和外周血T淋巴細胞亞群的變化。方法流式細胞儀檢測老年大鼠(10只)和青年鼠(5只)脾臟和血液T淋巴細胞亞群的變化。結果SD老年大鼠脾臟和外周血T淋巴細胞亞群陽性率的變化相一致，CD3+、CD4+、CD8+細胞陽性率均低于青年組水平，且CD4細胞陽性率均明顯低于青年組(P<0.05)；CD4+/CD8+比值均低于青年組，在脾臟CD4+/CD8+比值與青年組相比具有顯著性差異(P<0.05)。結論SD老年大鼠脾臟和外周血T胞亞群陽性率均減少，且CD4+/CD8+比值明顯降低，提示SD老年大鼠免疫功能的衰退和紊亂與T細胞密切相關。

關鍵詞〔〕脾臟；外周血；淋巴細胞；流式細胞技術

中圖分類號〔〕R57〔

基金項目：張家口市科技攻關計劃(12110065G-1)；河北北方學院自然科學研究計劃項目(No.2001022)

第一作者：張江蘭(1981-),女,講師,主要從事胃潰瘍病及其神經免疫調節研究。

在免疫系統中，各淋巴細胞亞群之間相互作用，維持著機體的正常免疫功能，隨著年齡的增長，各淋巴細胞亞群的數量和功能均會發生不同程度的改變。美國病理學家Wolford首次提出老化的免疫學假設，認為免疫系統是調節老化過程的主要系統之一，其從根本上參與了機體老化的整個過程〔1〕。本實驗通過免疫熒光標記流式細胞技術檢測SD老年大鼠脾臟和外周血淋巴細胞各亞群的變化。

1材料與方法

1.1材料20月齡SD老年大鼠共10只，6月齡SD青年鼠5只，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。然后在本組長期飼養，體重280～300 g。小鼠抗大鼠單克隆抗體：CD3-PE、CD4-FITC、CD8-FITC和10×細胞裂解液(FACS Lysing Solution)，均購自美國BD/Pharmingen 公司。流式細胞儀(FACS Aria)購自美國BD公司。

1.2取材用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉。動物被麻醉后，迅速開胸，心臟穿刺取血，放置于肝素抗凝管中，行流式細胞儀檢測；迅速開腹，采取脾組條，立即進行FACS檢測。

1.3脾臟組織淋巴細胞亞群檢測采集大鼠脾臟組織，放入200目不銹鋼篩網，使用注射器針心研磨；收集細胞，沉降5 min，轉入另一肝素抗凝試管中，1 500 r/min，離心10 min，棄上清；加入紅細胞裂解液2 ml充分混勻，避光放置10 min，4℃ 1 500 r/min，5 min離心去上清，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液(pH7.4)洗滌；用細胞計數板進行計數1×106/ml，取300 μl細胞懸液，平均加入到2個上樣管中，每管分別加入CD3-PE/CD4-FITC和CD3-PE/CD8-FITC，同時設立空白對照組(不加任何抗體)，4℃避光反應30 min，4℃ 1 500 r/min，5 min離心去上清；0.01 mol/LPBS緩沖液(pH7.4)洗滌；加200 μl PBS重懸細胞，逐個安放在流式細胞儀上進行檢測。數據用Cellquest3.1進行熒光參數的獲取和分析。在進行流式分析時，首先射門于淋巴細胞，然后射門于CD4+和CD8+細胞，分析各淋巴細胞亞群的陽性率。

1.4外周血淋巴細胞亞群的檢測每只動物取抗凝血300 μl平均加入到2個上樣管中，每管分別加入CD3-PE/CD4-FITC和CD3-PE/CD8-FITC，同時設立空白對照組(不加任何抗體)，4℃避光反應30 min；每管加入1×細胞裂解液2 ml充分混勻，避光放置10 min，4℃ 1 500 r/min，5 min離心去上清，0.01 mol/L PBS緩沖液(pH7.4)洗滌2次；加200 μl PBS重懸細胞，逐個安放在FACS上進行檢測。

1.5統計學處理用SPSS13.0 統計軟件行ANOVA方差分析及q檢驗。

2結果

SD老年大鼠脾臟和外周血各淋巴細胞亞群陽性率的變化一致，CD3+、CD4+、CD8細胞陽性率均低于青年組水平；其中CD4+細胞陽性率均明顯低于青年組(P<0.05)；脾臟和外周血CD4+/CD8+比值均低于青年組，兩組脾臟CD4+/CD8+比值差異顯著(P<0.05)。見表1。

表1　老年SD大鼠脾臟和外周血T淋巴細胞亞群的

與青年組比較：1)P<0.05

3討論

淋巴細胞各亞群數量的減少和功能的改變是老年人免疫功能衰退的重要因素。本研究發現老年SD大鼠脾臟和外周血總T淋巴細胞(CD3+)，抑制性、殺傷T淋巴細胞(CD8+)，輔助性T淋巴細胞(CD4+)陽性率均較青年組低。老年人免疫器官的衰退, 最突出的表現是T、B細胞的功能減退, 對非特異性有絲分裂原PHA、ConA及外來抗原反應性降低, 導致免疫功能下降, 易發生感染。陳海英等〔2〕研究顯示老年組的胸腺細胞大量萎縮或凋亡，從胸腺遷移到外周活化的T細胞減少，這被認為是老年脾臟和外周血T細胞數量減少的主要原因之一；同時，T細胞功能也隨增齡而惡化，造成細胞對外界信號的反應性和胞內信號的傳導異常〔3〕，且表達抗bcl-2抗凋亡蛋白水平增高〔4〕，使具有免疫能力的T細胞持續的存活，這不僅使機體免疫功能下降，還可能會對自身產生攻擊, 使機體易患自身免疫病、病毒感染和腫瘤等多種疾病。

同時，CD4+和CD8+細胞是一對相互制約的細胞〔5，6〕,生理狀態下其數目在周圍組織中保持相對穩定,以維持機體正常的細胞免疫功能，且CD4+/CD8+值可反映機體的細胞免疫功能狀態，其值增高或降低都將影響機體的免疫功能異常或紊亂〔7〕，導致臨床上許多疾病的產生。本實驗證實SD老年大鼠細胞免疫功能異常和紊亂，也是機體免疫功能下降的重要原因。

總之，機體免疫老化是一個非常復雜的過程，對其具體機制的研究具有重要的意義。本實驗發現SD老年大鼠免疫系統功能的衰退與T淋巴細胞亞群數量的減少和功能降低密切相關，為機體免疫衰老機制的研究提供了實驗依據。

4參考文獻

1何維.在免疫老化中T細胞結構和功能的變化〔J〕.中國免疫學雜志,2001;17(1):57-60.

2陳海英,陳建明,鄭建盛.胸腺細胞漸進性凋亡對大鼠脾臟淋巴細胞增殖功能的影響〔J〕.長治醫學院學報,2009;23(2):95-8.

3趙嵐,韓鸚贏,沈鵬,等.CD4+CD25+調節性T細胞與衰老關系的研究進展〔J〕.國際老年醫學雜志,2010;31(4):157-61.

4王真,鄧洪斌,李電東.衰老小鼠脾臟T淋巴細胞凋亡特征的變化〔J〕.中華老年醫學志,2003;22(11)：669-72.

5李春紅,董磊,李柏青,等.實驗性矽肺大鼠外周血和脾T 淋巴細胞亞群的動態變化〔J〕.環境與職業醫學,2007;24(5):494-7.

6潘志文,楊凡,萬海英.不同認知功能老年人淋巴細胞亞群和超敏C反應蛋白分析〔J〕.同濟大學學報(醫學版),2007;28(6):96-9.

7許麗艷，張盈華，尹國武，等.子宮內膜癌患者T細胞亞群、紅細胞免疫與Ag、NORs定量分析的臨床意義〔J〕.第四軍醫大學學報，2001;22(4): 353-5.

〔2014-05-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

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