新宮頸癌腫瘤標志物P16自身抗體的表達

新宮頸癌腫瘤標志物P16自身抗體的表達

于士龍1陳健1金剛1孫寶勝2李彥豪

(南方醫科大學南方醫院，廣東廣州510515)

摘要〔〕目的研究早期宮頸惡性腫瘤、宮頸良性腫瘤和健康人群P16自身抗體表達情況。方法利用自行設計的P16表位多肽片段作為包被抗原，采用改良EliSA方法檢測141例宮頸癌患者、133例宮頸良性腫瘤患者和148例健康志愿者血漿中P16自身抗體的表達情況。結果惡性腫瘤組P16自身抗體表達水平顯著高于健康對照組(t=4.016，P<0.001)和良性腫瘤組(t=3.879，P<0.001)。Ⅰ期宮頸癌組和Ⅱ期宮頸癌組P16表達水平明顯高于健康人群(t=7.800，P<0.001;t=5.198，P<0.001)及良性腫瘤組(t=4.466，P<0.001；t=2.288，P<0.001)，且Ⅰ期宮頸癌組與Ⅱ期宮頸癌組P16自身抗體表達水平存在差異(t=2.012，P<0.05)。宮頸癌組特異度為90%時，敏感度15.6%，曲線下面積為0.652。Ⅰ期宮頸癌組抗P16的IgG自身抗體特異度為90%時，敏感度達到了20.3%，曲線下面積為0.719。結論P16作為一種腫瘤相關抗原，其自身抗體可以反映出宮頸病變的連續發展變化，可能是早期診斷宮頸病變的一種潛在血清學標志物。

關鍵詞〔〕自身抗體；腫瘤相關抗原；宮頸癌；P16

中圖分類號〔〕R737.33〔

通訊作者：李彥豪(1953-)，男，教授，博士生導師，主要從事介入放射學研究。

1吉林省腫瘤醫院介入科2吉林省腫瘤醫院放療科

第一作者：于士龍(1976-)，男，在讀博士，主治醫師，主要從事介入放射學研究。

相關研究表明，P16 基因是一種腫瘤抑制基因，可直接作用于細胞周期，抑制細胞分裂，使細胞周期停滯在G1期。因此，P16基因失活可能是細胞惡化的關鍵。腫瘤發生時，腫瘤內異常表達的蛋白、多肽等會成為腫瘤相關抗原(TAAs)，刺激機體免疫系統產生特異性自身抗體。研究表明TAA自身抗體在多種惡性腫瘤患者中表達明顯升高〔1～5〕，檢測腫瘤患者血清中TAAs自身抗體可達到診斷或輔助診斷相關腫瘤的目的。在我們前期的工作中，應用線性肽代替重組蛋白作為TAA抗原的ELISA法檢測自身抗體，已經證實具有MHC-Ⅱ類表位的線性肽可以與自身抗體結合，并在多種腫瘤檢測中具有較高的敏感性。我們已發現P16自身抗體在食管癌和非小細胞肺癌患者中表達明顯高于健康人群，然而宮頸癌中腫瘤自身抗體的研究鮮有報道。本研究擬探討P16自身抗體在宮頸腫瘤人群血清中的表達趨勢及意義。

1材料與方法

1.1樣品來源樣品來自吉林大學第二醫院300名初次確診為宮頸癌的女性患者。均由影像學和病理組織學診斷確認，具有全面的臨床資料信息，并在血漿樣品采集前未進行任何抗癌治療。同時招募150名健康女性，采集外周血作為健康對照樣本。所有研究對象均為中國人，同時給予書面知情同意書，經吉林大學倫理委員會批準。由于首次就診的晚期患者非常少，樣本少見，且晚期宮頸癌的診斷方法臨床上已經很成熟，所以本次研究只納入Ⅰ期和Ⅱ期宮頸癌患者為惡性腫瘤組，剔除Ⅲ期和Ⅳ期宮頸癌的樣品。另外，剔除患有嚴重自身免疫疾病和其他腫瘤的樣本。符合研究要求的腫瘤樣本共274例，其中宮頸良性腫瘤133例，惡性腫瘤141例。符合要求的健康對照148例。

1.2自身抗體檢測方法采用改良的ELISA法對P16 IgG自身抗體進行檢測。線性抗原肽根據人白細胞抗原Ⅱ型(HLA-Ⅱ)設計而成，能與人類p16蛋白對應并攜帶能被多于90%的中國人識別的重疊限制表位，純度>95%，同時選取與人類抗原表位不相同的玉米多肽抗原作為參照抗原。合成肽用67%冰醋酸溶解，得到5 mg/ml 的抗原存儲液，使用前用含有0.1%疊氮鈉NaN3(S2002，Sigma-Aldrich)的磷酸鹽緩沖液(PBS，P4417，Sigma-Aldrich)將P16抗原和對照玉米抗原分別稀釋至10 μg/ml。將稀釋后的P16抗原及對照玉米抗原以0.1 ml/孔的量包被96孔平底透明微量滴定板(產品號3590，ImmunoChemistry Technologies)。96孔板用封板膜封閉后，4℃下孵育過夜。將抗原包被的96孔板用含Tween?20的Tris鹽緩沖液(TBS)清洗三次。用分析液按1∶150稀釋血漿樣本(100 μl/孔)，同時將分析液(100 μl/孔)加入陰性對照孔中。在37℃孵箱中孵育1.5 h后洗板3次，加入以1∶20 000倍稀釋的過氧化物酶標記羊抗人IgG抗體(A8667，Sigma-Aldrich、100 μl/孔)，封板膜封閉后在37℃孵箱中孵育1 h。然后洗板3次，加入顯色劑四甲基聯苯胺(TMB，S1301，Life Technologies)每孔100 μl，顯色20～30 min后加入50 μl終止液(10.9%的硫酸溶液)。將酶標儀波長設定為450 nm及620 nm作為參考波長，在終止反應后10 min內，測定樣品的光密度(OD)值。為了避免非特異吸收信號的干擾，用特意結合指數(SBI)表示血漿中循環自身抗體P16的水平。SBI=〔P16抗原(OD)-NC(OD)〕/〔對照抗原(OD)-NC(OD)〕

1.3統計學分析采用SPSS21.0軟件行獨立樣本t檢驗；利用受試者工作特征曲線(ROC)分析特異性>90%的情況下ELASA方法的敏感性。

2結果

2.1各組之間P16自身抗體表達水平比較惡性腫瘤組P16自身抗體表達水平(1.196±0.227)顯著高于健康對照組(1.098±0.188)(t=4.016，P<0.001)及良性腫瘤組(1.093±0.212)(t=3.879，P<0.001)。良性腫瘤組P16自身抗體表達水平與健康對照組之間無明顯差異(t=0.209，P=0.834)。P16自身抗體的表達水平在健康對照組、良性腫瘤組和惡性腫瘤組中有依次升高的趨勢。

2.2不同腫瘤分期間P16自身抗體表達水平的比較Ⅰ期宮頸癌組(1.331±0.212)和Ⅱ期宮頸癌組(1.244±0.234)P16表達水平明顯高于健康人群(t=7.800，P<0.001;t=5.198，P<0.001)及良性腫瘤組(t=4.466，P<0.001；t=2.288，P<0.001)。Ⅰ期宮頸癌組與Ⅱ期宮頸癌組P16自身抗體表達水平也存在差異(t=2.012，P<0.05)，有統計學意義。

2.3ROC分析惡性腫瘤組IgG檢測在特異度90%時，敏感度15.6%，曲線下面積為0.652(SE=0.032，95%CI:0.588～0.715)。Ⅰ期宮頸癌組IgG檢測在特異度90%、敏感度20.3%時，ROC為0.719(SE=0.039，95%CI:0.642～0.796)；Ⅱ期宮頸癌組IgG檢測在特異度90%時，敏感度12.2%，ROC為0.604(SE=0.040，95%CI:0.525～0.682)。見圖1。

圖1　宮頸癌及其各分期中P16自身抗體的ROC分析

3討論

大量研究表明，機體對自身腫瘤成分能夠產生體液免疫反應〔6，7〕，從而產生腫瘤相關抗原自身抗體。免疫應答在癌癥早期起到生物信號放大作用，使得在腫瘤抗原水平很低，利用常規蛋白檢測方法無法檢出時，就可以檢測到該腫瘤抗原自身抗體的異常表達〔7，8〕。因此血清中自身抗體的水平對監測腫瘤的發生具有重大意義〔9〕。

研究證實P16蛋白在宮頸癌組織中表達增高〔10，11〕，過表達的P16蛋白可刺激機體免疫系統產生更多的P16自身抗體。本研究結果提示P16自身抗體可以成為宮頸癌發生的生物標記物，并且在宮頸癌發生早期具有重要的診斷價值，與Jin等〔12〕和FOXP3〔13〕自身抗體在Ⅰ期食管癌中表達最高的研究結果相類似，進一步證實自身抗體在腫瘤早期診斷的潛在作用。P16基因在宮頸癌中的表達與其抑癌基因形象并不相符，P16蛋白在宮頸癌中表達升高，并隨著病變加重有逐漸升高的趨勢。目前對于P16蛋白升高主要存在兩種解釋。首先P16蛋白的表達升高可能與Rb基因失活有關。在正常宮頸組織中pRb可抑制P16基因的表達，P16與pRb之間通過負調節維持著兩者之間的精確平衡。當宮頸癌發生時，Rb基因的失活導致功能性pRb蛋白缺失，進而使得P16的抑制解除，導致P16表達升高。其次，研究報道P16的表達升高可能與HPV的感染有關。已證實HPV感染是導致宮頸癌發病的主要原因。HPV感染引起P16高表達的機制可能是HPV癌基因E6、E7編碼的癌蛋白，能分別與宿主的抑癌基因產物P53和pRb結合，導致P53表達下降和pRb功能喪失，使其對P16的負反饋調節作用喪失，從而導致P16蛋白在宮頸癌中過度表達。多數腫瘤中都能檢測到Rb基因的失活，但僅只發現在宮頸癌、頭頸部鱗癌等少數癌中存在P16蛋白的過表達的現象。雖然宮頸癌發生中HPV感染與P16蛋白表達升高的內在機制尚不清楚，但HPV感染誘導P16蛋白表達升高為P16自身抗體作為宮頸癌的生物標記物提供了有力的理論基礎。

敏感度和特異度是血清學診斷標志物重要的衡量指標。Li等〔14〕和Zhang等〔15〕分別以TAA重組蛋白為抗原檢測了卵巢癌和肝癌中P16自身抗體的表達，其敏感性分別為25%和21.8%。Liu等〔16〕和Ye等〔17〕用同樣方法對乳腺癌進行檢測，敏感性分別為14.3%和12.2%。以上研究中發現P16自身抗體檢測在腺癌中較為敏感，而在鱗癌檢測中，Zhou等〔18〕以TAA重組蛋白為抗原檢測食管癌，P16敏感性較低。傳統腫瘤標志物在良性腫瘤中也有升高的現象，是限制診斷敏感性的因素之一。之前的研究很少納入良性組，本研究中雖然良性組和健康組之間不存在差異，但是惡性組顯著高于良性組，這也說明P16自身抗體在宮頸惡性腫瘤診斷方面具有顯著優勢。

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〔2014-10-17修回〕

(編輯徐杰)