梗阻性黃疸大鼠膽道外引流術前術后肝臟中轉化生長因子β1表達

梗阻性黃疸大鼠膽道外引流術前術后肝臟中轉化生長因子β1表達

韓云秦偉楊生虎李曉峰楊立平

(青海大學附屬醫院腹部腔鏡外科，青海西寧810001)

摘要〔〕目的探討轉化生長因子(TGF)-β1在梗阻性黃疸大鼠膽道外引流術前后肝臟中的表達。方法監測梗阻性黃疸大鼠膽道外引流術前及術后不同時間組及假手術組TGF-β1的表達強度。結果TGF-β1在梗阻性黃疸大鼠膽道外引流術前表達強度較高，術后3、6、9 d表達強度逐漸下降，與假手術組有明顯差異(P<0.05)。結論①TGF-β1在梗阻性黃疸大鼠膽道外引流術前術后肝臟中的表達存在顯著差異，術后不同時段差異不同，術后隨時間推移TGF-β1表達減弱。②膽道外引流術可改善梗阻性黃疸大鼠肝損傷，越早引流肝損傷恢復越快。

關鍵詞〔〕轉化生長因子(TGF)-β1;梗阻性黃疸;膽道外引流

中圖分類號〔〕R657.4+3〔

第一作者：韓云(1975-)，男，主治醫師，主要從事腹部腔鏡外科研究。

對重度梗阻性黃疸患者進行術前膽道外引流減黃是否可以提高手術耐受性及減黃后何時進行手術，選擇最佳的手術時機，目前尚存在爭議〔1〕。本實驗在不同時間點觀察梗阻性黃疸大鼠行膽總管外引流手術前后肝臟中轉化生長因子(TGF)-β1的表達，以此推斷膽道外引流減黃后的最佳手術時機。

1材料與方法

1.1梗阻性黃疸大鼠模型制作選擇健康雄性SD大白鼠120只，體重180～220 g〔蘭州大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(甘)2009-004〕。隨機分成8組，每組15只(術后0、3、6、9 d假手術組，行膽道外引流術后0、3、6、9 d實驗組)。各組均于手術前晚禁食。均采用苯巴比妥鈉(50 mg/kg)行腹腔注射麻醉后，無菌條件下經劍突下正中小切口2 cm進腹，提出十二指腸探及膽總管，假手術組僅游離膽總管，然后關腹。實驗組在接近十二指腸處游離出一段長約1 cm的膽總管。用0/3絲線結扎膽總管,然后腹腔注射醫用透明質酸鈉(1 ml)，用0/3絲線縫合腹壁切口。術后常規喂養。膽總管結扎24 h后，實驗大鼠的尿液顏色逐漸變黃并加深，2～3 d后，皮毛開始逐漸轉黃，進食開始減少。經膽道引流后尿液及皮毛顏色開始轉淺。實驗過程中實驗組共有6只意外死亡，假手術組無死亡。

1.2膽道置管建模術后10 d，實驗組在原切口進腹，找到擴張的膽總管，并將靜脈輸液針導管(0.55 mm×19 mm)置入膽總管后用0/5絲線雙重結扎膽總管，將置入膽總管的引流管在右側腹壁皮下打隧道后，從隧道引出體外(在大鼠兩耳之間，用20#靜脈穿刺針穿刺，穿刺針在皮下潛行直達切口右側，然后自腹壁穿入腹腔內，將穿刺針頭端套入膽總管引流管，逐漸退針后，將膽總管引流管通過皮下自大鼠頭部兩耳之間穿刺處引出體外)，并固定引流管，查看膽總管有無膽漏后，用生理鹽水將腹腔沖洗干凈，再用0/3絲線縫合腹壁切口。

1.3TGF-β1檢測各組于術后0、3、6、9 d采用脫頸法分別處死大鼠。剪取肝臟組織，包埋后制成蠟塊,然后制成切片(厚度5 μm), 分別行免疫組織化學染色和HE染色。再檢測TGF-β1(Envision法)。TGF-β1是以細胞質著色為主，以細胞質呈現棕色顆粒狀為陽性染色標準，并且細胞質的著色高于背景〔2，3〕。按切片中細胞染色的強度計0、1、2、3分(0分：細胞無染色；1分：細胞呈淺黃色；2分：細胞呈棕黃色；3分：細胞呈褐色)；再按切片中顯色細胞比例計0、1、2、3分(每張切片隨機觀察5個高倍視野，并計500個細胞中陽性染色的細胞數。0分：細胞無陽性染色，1分：陽性染色細胞數<30%染色，2分：陽性染色細胞數在30%～70%，3分：陽性染色細胞數≥70%)。每張切片細胞染色積分=比例計分×強度計分。按積分的高低分為4個級別: 陰性(-)0分；弱陽性(+)1～3分；陽性(++)4～6分；強陽性(+++)7～9分〔4，5〕。

1.4統計學方法采用SPSS13.0統計軟件進行t檢驗。

2結果

2.1肝功能變化實驗組各時間點總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)和γ-谷氨酰轉肽酶(GCT)水平與假手術組差異顯著(P<0.05),實驗組3，6，9 d上述指標與引流0 d差異顯著(P<0.05)。見表1。

表1　兩組膽道梗阻外引流前后不同時間點肝功能變化 ± s, n=15)

與假手術組比較：1)P<0.05；與 引流0 d比較：2)P<0.05

2.2各組肝臟組織TGF-β1表達光度實驗組各時間點肝臟組織TGF-β1表達光度與假手術組差異顯著(P<0.05),實驗組3，6，9 d TGF-β1表達光度與引流0 d差異顯著(P<0.05)。見表2。

表2兩組術后各時間點肝臟組織TGF-β1表達光度

分組0d3d6d9d假手術組1.26±1.381.27±1.351.29±1.391.28±1.41實驗組5.94±2.311.42±1.561)3.19±2.161)5.67±2.281)P值0.0210.0360.0310.028

與引流0 d比較：1)P<0.05

3討論

梗阻性黃疸是肝、膽、胰外科疾病中較常見的一種臨床表現，又稱為外科黃疸，嚴重梗阻性黃疸病人外科手術并發癥的發生率和死亡率都較高，據報道〔6〕分別為40%～60%、15%～25%；目前術前減黃多采用經皮肝穿刺置管引流(PTCD)及內鏡下鼻膽管引流術(ENBD)，雖然術前膽道外引流能降低血液中膽紅素濃度, 減輕患者黃疸的程度，但并不能糾正電解質紊亂，改善凝血功能，對個別肝細胞損害嚴重的黃疸病人減黃效果較差〔7〕。由于膽汁淤積，在腎小管、心肌和胃腸道黏膜下膽鹽的沉積直接損害這些臟器的功能，從而引起腎衰竭、心功能下降等一系列并發癥，導致特異性和非特異性細胞免疫功能的損害，反而可以增加并發癥的發生,如胰漏、膽道出血、膽漏、內毒素血癥及術后感染等。

針對能夠進行手術治療的惡性梗阻性黃疸患者，手術前通過膽道外引流改善肝功能及全身狀況，為手術創造良好條件的時機選擇難度較大〔8，9〕。本研究顯示： TGF-β1在梗阻性黃疸大鼠模型肝臟中的表達較高，而膽道外引流術后隨著時間的推移肝臟中的表達明顯降低。尤其以膽道外引流早期TGF-β1的表達下降趨勢較明顯。發生梗阻性黃疸不及時外引流干預，肝臟水腫程度逐漸加重，功能受損，膽汁停止分泌，到后期可能產生不可逆的損害〔10，11〕。因此，對梗阻性黃疸診斷明確后，越早進行減黃干預，效果越好〔12〕。

4參考文獻

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3唐仕芳，朱洪春，李華強，等.轉化生長因子β1在新生大鼠高濃度氧致肺損傷中的作用研究〔J〕.重慶醫學,2009; 38(4)：438-40.

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9詹國情，董家鴻，王槐志，等.損傷性膽管狹窄手術時機探討〔J〕.第三軍醫大學學報，2002；24(9)：1120-1.

10李冰.TGF-β1在梗阻性黃疸大鼠膽道外引流術后膽總管中的表達〔J〕.西寧：青海大學碩士論文，2012.

11李曉峰，張杰，郭俊武，等.TGF-β1在梗阻性黃疸大鼠膽總管中的表達〔J〕.青海醫藥雜志，2012；42(6)：4-6.

12Patsenker E，Popov Y，Stickel F，etal.Inhibition of integdn alphavbeta on cholangiocytes blocks transforming growth factor-beta activation and retards biliary fibrosis progression〔J〕.Gastroenterology，2008;135：660-70.

〔2013-12-13修回〕

(編輯苑云杰)