右歸丸及其拆方干預對老年腎陽虛證患者基因差異表達的影響

·基礎研究·

右歸丸及其拆方干預對老年腎陽虛證患者基因差異表達的影響

唐楊1，2項磊1周衛東1孫曉敏劉艷艷3羅仁1趙曉山

(南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州510515)

摘要〔〕目的觀察右歸丸及其拆方對老年腎陽虛證患者基因差異表達的影響。方法選取年齡在60歲以上的腎陽虛證患者8例進入研究，按隨機數字法將其分為兩組(右歸丸組及溫腎陽組各4例)，另將4例60歲以下健康人設為正常對照組。分別觀察治療前及療程結束后兩組臨床癥狀總積分，比較外周血白細胞的6條基因(SYPL1、PHF14、ARHGAP18、RECQL、OSTF1和SEC23B)的差異表達，并以GAPDH作為內參對照。結果右歸丸組及溫腎陽組連續用藥2個療程后，癥狀總積分在治療前后均有統計學差異(t右歸丸=20.657，P<0.01，t溫腎陽=51.000，P<0.01)；治療后兩組間總積分比較有統計學差異(F=74.432，P<0.01)。RT-PCR結果顯示，SYPL1基因，在右歸丸組和溫腎陽組的表達水平均存在統計學差異(t左歸丸=-35.631，t溫腎陽=-13.000，P<0.01)，且治療后右歸丸組和溫腎陽組的表達均較治療前上升。治療后各組的SYPL1基因表達存在差異(F=487.049，P<0.01)，溫腎陽組表達上升程度不及右歸丸組。其他5種基因的表達情況與SYPL1基因狀況類似。結論(1)右歸丸及溫腎陽中藥復方對老年腎陽虛患者的基因差異表達均有改善作用，右歸丸優于單純溫腎陽復方治療效果，驗證了陰中求陽法的優越性。(2)老年腎陽虛患者的基因表達在短期內不能單獨依靠藥物恢復至完全正常，需要一個長期和綜合的治療過程。

關鍵詞〔〕右歸丸；腎陽虛證

中圖分類號〔〕R2-03〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(81173146，81202622)；NSFC-廣東聯合基金重點項目(No.U1132001)；廣東省科技廳與廣東省中醫藥科學院聯合基金資助項目(No.2011B032200004，2013A032500008)；廣東省科技計劃(No.2011B031700018)；廣州市科技計劃(2014Y2-00504)資助

通訊作者：趙曉山(1975-)，男，副主任醫師，研究員，主要從事常見慢性病的中西醫結合防治研究。

1南方醫科大學南方醫院中醫科2贛南醫學院第一附屬醫院中醫科

3廣州中醫藥大學第一附屬醫院風濕科

羅仁(1952-)，男，博士生導師，教授，副主任醫師，主要從事腎病腎虛證的中醫藥防治研究。

第一作者：唐楊(1982-)，女，主治中醫師，在職博士，主要從事腎虛證的防治研究。

Significance of differential gene expression in kidney-yang deficiency syndrome treated by Yougui pill and its decomposed formula

TANG Yang, XIANG Lei, ZHOU Wei-Dong,etal.

School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515,Guangdong, China

Abstract【】ObjectiveTo observe the differential gene expression in kidney-yang deficiency syndrome treated by Yougui pill.Methods8 patients above 60 years old with kidney-yang deficiency syndrome were included. The patients were randomly divided into Yougui pill treatment and nourishing Yang control group(n=4), another 4 healthy people under the age of 60 were set as normal control group. Each patient took the medicine for 4 weeks. The differential gene expressions for 6 genes(SYPL1,PHF14 ,ARHGAP18,RECQL,OSTF1 and SEC23B) pretherapy and post-treatment were observed respectively.ResultsAfter one course of treatment, the symptom integral had statistically significant difference within the treatment and control groups pretherapy and post-treatment(tt=20.657,P<0.01;tc=51.000，P<0.01),and the treatment group was superior to control groups in relieved the symptoms of kidney-yang deficiency syndrome(F=74.432，P<0.01); RT-PCR showed the difference of expression level of gene SYPL1 in Yougui pill group and nourishing Yang was statistically significant(P<0.01)pretherapy and post-treatment,both of the expressions of SYPL1 in two groups were increased than those of pretherapy.There were differences of gene expressions among every groups post-treatment(F=487.049,P<0.01). The other 5 genes' expressions were similar to that of SYPL1.ConclusionsThe gene expression in elderly patients with kidney-yang deficiency can not rely on medicaments to completely return to normal alone in the short term, which need a long-term and comprehensive treatment process.

【Key words】Yougui pill; Kidney-yang deficiency

中醫學認為人衰老與腎密切相關。腎陽為腎中精氣屬陽的部分，具有溫煦、升騰、推動、興奮和氣化等屬性。人體陽氣不足時，機體會出現畏寒肢冷，面色晄白，小便清長、下得清谷、舌質淡苔白，脈沉遲等腎陽虛證的癥狀。老年人腎虛發生率為78.80%，其中腎陽虛證占腎虛總數的5.70%，且呈增齡性增加〔1〕。右歸丸為明代張景岳所創，以“陰中求陽”治法來治療腎陽虛證，在理論上與單純的溫陽治法相比更具特色及科學性。本課題組既往的研究表明〔2〕，腎陰虛證和腎陽虛證與正常對照比較外周血白細胞中存在6條共同差異表達下調的基因SYPL1、PHF14、ARHGAP18、RECQL、OSTF1和SEC23B，這些可能是腎虛證表達下調的相關基因，但其機制尚未完全闡明。本研究旨在通過RT-PCR法觀察經右歸丸及其拆方對老年腎陽虛證患者治療前后相關基因差異表達的變化。

1對象與方法

1.1研究對象按實驗分組要求收集贛南醫學院第一附屬醫院及南方醫科大學南方醫院2012年9月至2014年7月間診治病人。納入標準：采用病證結合手段，選取年齡在60歲以上，患慢性腎炎的腎陽虛證患者作為研究對象。排除標準：不符合納入標準者；處于心腦血管、腫瘤、尿毒癥等重大疾病的終末期；不愿接受研究者。

1.2腎陽虛證的辨證標準根據被調查者填寫的量表內容和現場調查醫師通過中醫四診掌握的資料，按《中醫診斷學》〔3〕、1986年全國虛證與老年病會議制定的《中醫虛證辨證參考標準》〔4〕，有關腎虛證的辨證標準、國家中醫藥管理局頒布《中醫病證診斷療效標準》等有關腎陽虛證的診斷標準。主癥：腰膝酸軟，性欲減退，畏寒肢冷；次癥：精神萎靡，夜尿頻多，下肢浮腫，動則氣促，發槁齒搖，舌質淡苔白，脈沉遲，尺無力。診斷：具備以上主癥2項、次癥2項，即可確診。癥狀積分按腎陽虛證每項證候的輕、中、重程度分級量化為1分、2分、3分，癥狀總積分為主癥各項證候積分和次癥各項積分的總和。

1.3分組共納入符合條件的8例老年腎陽虛患者進入研究，男5例，女3例，年齡(62±1.13)歲，按隨機數字法將其分為兩組，右歸丸組及溫腎陽組各4例。另將4例60歲以下健康人設為正常對照組，男2例，女2例，年齡(55±2.72)歲。按照中醫理論“陰中求陽”法，給予右歸丸及其拆方治療進行腎陽虛證研究：右歸丸治療組，給予右歸丸(由熟地、山藥、山茱萸、枸杞、鹿角膠、菟絲子、杜仲、當歸、肉桂、制附子組成)免煎顆粒劑，每日2次，開水沖服；溫腎陽對照組，給予右歸丸之溫腎陽中藥復方(由鹿角膠、菟絲子、杜仲、肉桂、制附子組成)免煎顆粒劑，每日2次，開水沖服。4 w為1個療程，每例患者連續用藥2個療程，分別觀察治療前及療程結束后外周血白細胞的6條基因(SYPL1、PHF14、ARHGAP18、RECQL、OSTF1和SEC23B)的差異表達，并以GAPDH作為內參對照〔5〕。

1.4實驗試劑與儀器設備DNA抽提試劑及Trizol試劑，RNA抽提試劑，均為美國MRC公司產品；RNA Later 保存液，Ambion公司；實時定量PCR試劑，Takara公司；其余實驗所需常規化學試劑均來自廣州化學試劑一廠及北京博奧生物公司；實時熒光定量PCR儀ABI7500FAST，ABI公司；FeroTec Gradien PCR 基因擴增儀，北京市化學儀器廠。

1.5方法

1.5.1兩組治療前后癥狀總積分比較右歸丸組及溫腎陽組連續用藥1個療程后，觀察兩組治療前后的癥狀總積分變化。

1.5.2總RNA的提取和質檢采集研究對象晨起空腹抗凝外周靜脈血5 ml，參照Ambion公司RiboPureTM-Blood Kit的操作步驟制備白細胞；按操作規范提取樣品總RNA后，通過核酸定量儀判斷RNA質量，結果顯示RNA完整性較好，可以進行下一步驟。

1.5.3熒光實時定量PCR檢測利用GenBank查詢基因的堿基序列，采用引物設計軟件Primer 3.0。實時定量PCR測定的腎陽虛證6條基因及內參基因GAPDH引物見表1。

表1　腎陽虛證差異表達下調的6條基因及

cDNA模板制備(逆轉錄酶，RT)：在EP管中加入1 μl RNA、0.5 μl RNA酶抑制劑，0.5 μl Oligo、1 μl Rnase抑制劑，2 μl dNTPs，2 μl 5×Buffer，3 μl DEPC-H2O，將上述溶液混勻、離心，42℃水浴60 min，99℃5 min，冰上冷卻，-20℃保存，進行實時PCR，配置相應的RT-PCR反應體系：2倍master mix(IQ SYBR GRN SUPERMX)10.0 μl，PCR引物各0.5 μl，cDNA 1.0 μl，無菌水 8.0 μl。

將配置完畢的PCR反應液放置于熒光定量PCR儀上，反應條件：變性95℃ 3 min；然后95℃ 10 s，退火55℃ 10 s；延伸72℃，30 s，共反應39個循環。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后經凝膠成像系統拍照成像，目的基因的表達水平用其與GAPDH的相對平均灰度值表示〔6〕。

1.6統計學處理采用SPSS13.0軟件，組內比較采用配對設計資料的t檢驗，兩組間比較使用方差分析、協方差分析、單因素方差分析(One-Way ANOVA)，有統計學意義再行LSD法多重比較。

2結果

2.1兩組治療前后癥狀總積分比較結果治療前兩組總積分比較無顯著性差異(右歸丸組25.50±3.51，溫腎陽組24.75±3.40,F=1.149，P>0.05)；兩組總積分在治療前后均有統計學差異(t右歸丸=20.657，P<0.01；t溫腎陽=51.000，P<0.01)，治療后兩組比較差異有統計學意義(右歸丸組8.50±1.29，溫腎陽組16.00±2.16,F=74.432，P<0.01)。

2.2腎陽虛證三組治療前后基因表達情況治療前后SYPL1基因，在右歸丸組和溫腎陽組的表達水平存在統計學差異(t左歸丸組=-35.631，t溫腎陽組=-13.000，P<0.01)，且治療后右歸丸組和溫腎陽組的表達均較治療前上升。治療后各組的SYPL1基因表達存在差異(F=487.049，P<0.01)，溫腎陽組表達上升程度不及右歸丸組。其他5種基因的表達情況與SYPL1基因狀況類似。見表2。

表2　6種基因治療前后表達

與對照組相比:1)P<0.01;與右歸丸組相比:2)P<0.01；與治療前相比：3)P<0.05

3討論

陰陽互根互用理論是陰陽學說的重要組成部分。陰陽學說的現代研究中最令人矚目的是美國生物學家Glodberg等〔7〕于1975年首次提出環磷酸腺苷(cAMP)與環磷酸鳥苷(cGMP)的陰陽假說。隨后國際上一系列著名的科學雜志刊登應用陰陽概念探討免疫與炎癥、氧化與抗氧化、蛋白磷酸化信號傳導通路、核轉錄因子抑制與激活等細胞內的諸多事件〔8～13〕。哺乳動物的基因表達具有陰陽屬性〔14〕。李白雪〔15〕研究發現miRNA從本質屬性上講，應屬于“陰”屬性，saRNA呈現積極、向上、促進等“陽”的屬性。沈自尹院士曾提出21世紀中醫藥學的主要發展趨勢將是建立中醫證的基因表達譜。分子生物學和生命的中心法則認為基因處于最原始和最本質的地位，主宰和制約著表型(蛋白質→細胞→有機體)程序的發生發展〔16〕。

右歸丸見明代著名醫家張景岳的《景岳全書》，方中以大量溫陽藥為主，配有幾味滋陰藥為輔，取“陰中求陽”之義，使元陽得以歸原，故得名“右歸丸”。所謂“善補陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助，而生化無窮”。本課題組既往研究發現，6條腎虛證共同差異表達下調的基因中，SYPL1(突觸泡蛋白樣1)的分子學上為轉運蛋白，在生物學過程中主要參與運輸、突觸傳遞以及傳遞神經沖動的功能； PHF14(PHD指蛋白14)的分子功能為蛋白結合、鋅離子結合及金屬離子結合，生物學過程主要參與調控轉錄和DNA依賴； ARHGAP18(Rho GTP 激活蛋白18)的分子功能為GTP激活、酶激活劑，生物學過程參與新陳代謝、GTP結合；RECQL(RecQ蛋白樣、DNA解旋酶Q1樣)的分子功能有核苷酸結合、DNA結合、ATP依賴DNA解旋酶、蛋白結合、ATP結合、水解酶等，生物學過程主要參與了DNA的修復、蛋白質的生物合成等； OSTF1(破骨細胞刺激因子1)分布于細胞內，其分子功能主要為蛋白結合、骨骼發育，其生物學過程參與骨化以及信號轉導等；SEC23B(Sec23同源物B)分布于細胞膜和內質網及高爾基堆疊等，其分子功能主要有蛋白結合、鋅離子結合、高爾基復合體和細胞質囊泡等，生物學過程參與了細胞內蛋白質的運輸、內質網高爾基膜泡介導運輸等。這6條基因可視為腎陽虛證研究時的特征基因。

本次研究可以總結出右歸丸及溫腎陽中藥復方對老年腎陽虛患者的基因差異表達均有改善作用，右歸丸優于單純溫腎陽復方治療效果，驗證了陰中求陽法的優越性。老年腎陽虛患者的基因表達在短期內不能單獨依靠藥物恢復至完全正常，需要一個長期和綜合的治療過程。

4參考文獻

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〔2015-07-15修回〕

(編輯曲莉)