P16及CyclinD1在胃癌癌變過程中的作用及意義

P16及CyclinD1在胃癌癌變過程中的作用及意義

劉亮張建海左連富

(河北醫科大學第四醫院腫瘤研究所流式細胞室，河北石家莊050011)

摘要〔〕目的通過檢測慢性萎縮性胃炎、胃不典型增生組織及胃癌組織中P16及CyclinD1蛋白的表達，探討P16及CyclinD1與胃癌發生及發展的關系。 方法利用免疫組織化學方法檢測慢性萎縮性胃炎、胃不典型增生組織及胃癌中P16及CyclinD1蛋白的表達水平，利用SPSS軟件進行胃癌組織中P16及CyclinD1蛋白表達相關性分析。結果P16蛋白在慢性萎縮性胃炎組織中的陽性表達率(91.7%)顯著高于不典型增生組織(69.2%)及胃癌組織(45%)中的表達(P<0.05)。CyclinD1蛋白在胃癌組織中的陽性表達率(65%)顯著高于胃不典型增生組織(34.6%)及慢性萎縮性胃炎組織(29.2%)中的表達(P<0.05)。統計學結果顯示，胃癌組織中P16及CyclinD1蛋白的陽性表達率呈顯著負相關(P<0.05)。 結論P16及CyclinD1蛋白異常表達在胃癌癌變早期即已發生，聯合檢測P16及CyclinD1可為胃癌早期診斷提供客觀指標。

關鍵詞〔〕胃癌；基因；細胞周期素；免疫組織化學

中圖分類號〔〕R735.2〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省醫學科學研究重點課題(20110131);河北省自然科學基金(H2013206446)

通訊作者：左連富(1949-)，男，教授，主要從事腫瘤病理學研究。

第一作者：劉亮(1981-)，男，副教授，博士，主要從事腫瘤的早期診斷及治療研究。

Role of P16 and CyclinD1 protein expression in the process of gastric cancer and its significance

LIU Liang,ZHANG Jian-hai,ZUO Lian-Fu.

Department of FCM Analysis,Tumor Institute,the Forth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,Hebei,China

Abstract【】ObjectiveTo explore the relationship between the P16 and CyclinD1 protein expression level and the development of gastric cancer by detecting the P16 and CyclinD1 protein expression in chronic atrophic gastritis,gastric dysplasia and gastric cancer tissue.MethodsExpressions of P16 and CyclinD1 protein in chronic atrophic gastritis,gastric dysplasia and gastric cancer tissue were detected by immunohistochemistry and the relationship between the P16 and CyclinD1 protein expression in gastric cancer was analyzed by SPSS software.ResultsThe positive expression rate of P16 protein in chronic atrophic gastritis(91.7%)was significantly higher than that of gastric dysplasia(69.2%)and gastric cancer tissue(45%)(P<0.05).The positive expression rate of CyclinD1 protein in gastric cancer tissue(65%)was significantly higher than that of gastric dysplasia(34.6%)and chronic atrophic gastritis(29.2%)(P<0.05).P16 and CyclinD1 protein positive expression rate in gastric cancer tissue was significantly negative correlation(P< 0.05).ConclusionsThere are abnormal expressions of P16 and CyclinD1 protein in early gastric cancer,the combined detection of P16 and CyclinD1 protein could provide objective index for early diagnosis of gastric cancer.

【Key words】Gastric neoplasms;Gene;Cyclin;Immunohistochemistry

胃癌是較常見的惡性腫瘤〔1〕，近年發病率上升〔2〕，然而，胃癌的病因及發病機制目前仍未闡明，為臨床上胃癌的早期診斷及治療帶來一定困難。目前對于腫瘤發生機制研究認為，多種癌基因及抑癌基因的異常從而導致了腫瘤的發生。p16基因是抑癌基因，對正常細胞周期起負調控作用，同時是抑制腫瘤細胞生長的關鍵因子〔3,4〕。CyclinD1基因是一種原癌基因，是細胞周期的正性調控因子，可促進細胞增殖〔5〕。本課題探討P16及CyclinD1蛋白在不同病變的胃組織中的表達水平。

1材料與方法

1.1組織標本采用河北省腫瘤研究所病理研究室存檔胃鏡咬檢的石蠟包埋胃黏膜組織50例(慢性萎縮性胃炎24例，不典型增生26例)及河北醫科大學第四醫院病理科2003年2月至2003年8月手術切除胃癌標本20例，均有完整的病理資料。其中不典型增生組織輕度14例，中重度12例；胃癌組織中，中高分化9例，低分化11例。所有標本常規石蠟包埋制成4 μm厚切片4張，其中一張切片HE染色進行病理形態學觀察，其余3張切片用于免疫組織化學染色。

1.2主要儀器及試劑鼠抗人p16單克隆抗體(ZM-0205;克隆系：16P07)，鼠抗人細胞周期素D1單克隆抗體(ZM-0084;克隆系：DCS-6)，Sp試劑盒(sp-9000)及DAB顯色劑，美國Santa Cruz公司。

1.3免疫組織化學染色方法福爾馬林固定、石蠟包埋的病理組織塊切成4 μm厚切片，每個蠟塊各做4張切片。第一張用于HE染色，第二張用0.01%PBS代替一抗作為陰性對照，第三、四張分別行抗P16、CyclinD1抗體標記P16、CyclinD1蛋白，免疫組織化學染色用鏈菌素親生物素-過氧化物酶(SP)法。常規脫蠟至水，3%甲醇H2O2溶液室溫10 min，而后用蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min。檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)95℃以上孵化20 min。每張切片加5 μl 10% 山羊血清封閉10 min。分別滴加50 μl P16、CyclinD1(均為即用型)單克隆抗體，4℃冰箱過夜。其后PBS沖洗3次，每次5 min。滴加50 μl鏈霉素蛋白-過氧化氫酶溶液，用以標記二抗，孵育30 min，其后PBS沖洗3次，每次5 min。分別滴加50 μl辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液，室溫下孵育30 min，其后PBS沖洗3次，每次5 min。每張切片滴加100 μl左右新鮮配置的DAB溶液顯色，鏡下觀察顯色反應，顯色適度時終止反應，一般15～30 min。流水沖洗后，蒸餾水洗一次，蘇木素復染細胞核4 min后，分化，返藍，常規脫水、透明、封片。

1.4免疫組織化學方法檢測P16及CyclinD1蛋白表達判斷標準P16參照Geradts〔6〕標準，細胞核或細胞質著棕黃色為陽性細胞。陰性(-)表示未見陽性著色細胞，或僅有胞質著色而每高倍鏡下胞核著色細胞個數≤1；弱陽性(+)表示著色較淺或著色細胞數≤25%者；陽性()表示著色深度適中或著色細胞數占25%～50%者；強陽性()表示著色較深或著色細胞數>50%者；所有陽性樣本必須滿足每高倍鏡下核著色細胞個數≥2。CyclinD1參考Betticher等〔7〕標準：未見陽性細胞或陽性細胞表達弱，陽性細胞表達<20%為陰性(-)，中等強度的表達≥20%為陽性(+)，≥50%為強陽性()。

1.5統計學方法應用SPSS10.0統計學分析軟件對數據的組間比較進行分析，計數資料組間比較行χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析方法。

2結果

2.1不同胃病變組織中P16蛋白表達水平慢性萎縮性胃炎區域，可見腺上皮萎縮、變性，部分腺體呈囊性擴張，P16蛋白表達于細胞核和細胞質內，呈強陽性表達；B區為不典型增生區域，表現為腺體形狀大小不規則、分枝或囊性擴張，排列紊亂，上皮細胞數量增加，核變卵圓形或筆桿狀，排列擁擠，位于細胞的基底部，P16蛋白呈陽性表達；胃腺癌組織中腺管結構不明顯，癌細胞分化較差，大小不甚一致，核常呈復層，P16蛋白呈弱陽性表達(圖1)。各組樣本中均有不同程度的P16蛋白表達，P16蛋白在慢性萎縮性胃炎組中陽性表達率(91.7%)顯著高于不典型增生組(69.2%，P<0.05)，不典型增生組與胃癌組(45.8%)之間無顯著性差異(P>0.05)，輕度不典型增生組(78.6%)與中～重度不典型增生組之間無顯著性差異(58.3%，P>0.05)，中～高分化腺癌與低分化腺癌之間無顯著性差異(55.6% vs 36.4%，P>0.05)。

圖1　不同病變組織P16、CyclinD1蛋白表達(DAB，×100)

2.2不同胃病變組織中CyclinD1蛋白表達水平慢性萎縮性胃炎組織，CyclinD1蛋白表達于細胞核內，呈弱陽性表達； 不典型增生組織，CyclinD1蛋白呈陽性表達；胃腺癌組織，CyclinD1蛋白呈強陽性表達(圖1)。各組樣本中均有不同程度的CyclinD1蛋白表達，CyclinD1蛋白在胃癌組中陽性表達率顯著高于不典型增生組(65.0% vs 34.6%,P<0.05)，不典型增生組與慢性萎縮性胃炎組(30.4%)間無顯著差異(P>0.05)，中～重度不典型增生組與輕度不典型增生組之間無顯著性差異(50% vs 27.3%,P>0.05)，低分化腺癌與中～高分化腺癌之間無顯著性差異(81.8% vs 44.4%,P>0.05)，CyclinD1蛋白在慢性萎縮性胃炎組中表達率最低(29.2%)，隨著病變進展，其陽性表達率逐漸升高。

2.3胃癌組織中P16和CyclinD1蛋白表達水平相關性分析胃癌組織中P16和CyclinD1蛋白表達呈顯著負相關(r=-0.555，P=0.011)。

3討論

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，發病率居世界第二位，具有較強的局部侵襲和遠處轉移能力，致死率較高。胃癌的病因及發病機制目前仍未闡明，但研究發現癌癥的發生是多因素、多因子參與的，多種癌基因激活及抑癌基因的失活從而導致癌的發生及發展。

p16基因是由Kamb等〔8,9〕發現的抑癌基因，定位于p21不到40 kb的范圍內，由三個外顯子和兩個內含子組成。三個外顯子長度分別為126，307和11 bp，編碼一個16 kD的蛋白，即P16蛋白。P16既是正常細胞周期有效調控者(負反饋調節作用)，又是抑制腫瘤生長的關鍵成分。P16蛋白能與CyclinD1競爭性地結合CDK4和CDK6，抑制其活性，使其一系列底物(如pRb)保持持續去磷酸化高活性，而不能解除pRb對轉錄因子E2F等的抑制，從而阻止細胞G1期進入S期，直接抑制細胞增殖。因此，p16基因異常，可導致細胞異常增殖和腫瘤發生。

本研究顯示，各組樣本中均有不同程度的P16蛋白表達，P16蛋白在慢性萎縮性胃炎組中陽性表達率顯著高于不典型增生及胃癌組，P16蛋白在胃癌中表達率最低，隨著病變從慢性萎縮性胃炎→不典型增生→癌的進展，其陽性表達率逐漸降低，提示P16蛋白低表達與胃癌發生、發展有關。文獻報道〔10〕p16基因缺失是胃癌發生的早期事件。不典型增生與慢性萎縮性胃炎比較P16蛋白表達顯示明顯的差異至胃癌出現顯著缺失，其原因可能是P16基因以多種機制參與腫瘤的發生。

CyclinD1基因是一種原癌基因，由351個腺嘌呤、392個胞嘧啶、376個鳥嘌呤和206個胸腺嘧啶組成。Inaba等〔11〕報道了cyclinD1基因在11q13的位置上。Hinds等〔12〕證實了CyclinD1有致癌作用。CyclinD1是細胞周期的正性調控因子，與CDK4/CDK6結合并使之激活，活化的CDK4/CDK6使視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)在G1-S轉換期發生磷酸化，釋放出E2F，進一步激活S期相關基因的轉錄，推動細胞從G1期進入S期。本研究顯示，CyclinD1蛋白在胃癌組中陽性表達率顯著高于不典型增生及慢性萎縮性胃炎組，隨著病變從慢性萎縮性胃炎→不典型增生→癌的進展，其陽性表達率逐漸升高，與文獻報道一致〔13,14〕，提示CyclinD1蛋白高表達可能發生在胃粘膜上皮癌變的早期階段，是重要的胃癌促發因素，可將其認為是胃癌發生的早期事件。綜上，P16和CyclinD1蛋白異常表達在早期胃癌即已發生，且P16和CyclinD1蛋白表達呈現負相關性，聯合檢測P16和CyclinD1蛋白可為早期胃癌診斷提供客觀指標，提高臨床上早期胃癌的診斷率，對于臨床上胃癌的早期診斷及治療具有重要意義。

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〔2014-06-25修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

《中國老年學雜志》被國際數家數據庫、檢索性期刊檢索機構收錄情況

根據國際檢索機構給中國科學技術期刊編輯學會國際交流工作委員會、中國高等學校自然科學學報研究會對外聯絡委員會發來的電子郵件及其附件統計整理, 《中國老年學雜志》2009年又被4種國際重要檢索系統列為來源期刊:

1)美國化學文摘(CA)，CODEN ZLZHAO，http://www.lib.dlut.edu.cn/layersec.asp；

2)波蘭《哥白尼索引》(IC, Index of Copernicus), http://journals.indexcopernicus. com/karta. Php;

3)日本《科學技術社(中國文獻數據庫)》(JST, Japan Science & Technology Agency) (Chinese Bibliographic Database);

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