表沒食子兒茶素沒食子酸酯增強食管癌細胞對紫杉醇的敏感性

表沒食子兒茶素沒食子酸酯增強食管癌細胞對紫杉醇的敏感性

袁選舉陳萍王賢和鄧守恒

(湖北醫藥學院附屬人民醫院腫瘤中心,湖北十堰442000)

摘要〔〕目的觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)體外增強紫杉醇對食管癌CaEs-17細胞化療敏感性的作用，探討可能的作用機制。方法實驗分為空白對照組、紫杉醇組(培養液中紫杉醇終濃度為360 nmol/L)，EGCG組(培養液中EGCG終濃度為20 mg/L)、聯合組(培養液中EGCG終濃度為20 mg/L，紫杉醇濃度為360 nmol/L)，各組作用24 h，CCK-8法和細胞克隆形成法檢測細胞增殖抑制率和存活率，金氏公式評價二藥的協同效果；流式細胞儀檢測細胞凋亡率及周期分布；Transwell法檢測細胞侵襲力；免疫印跡法檢測P21蛋白表達水平。結果EGCG、紫杉醇均可抑制CaEs-17細胞增殖、誘導細胞凋亡、降低細胞存活率和侵襲力；減少S期細胞數量、阻斷細胞周期于G1期，并能上調P21蛋白表達水平(P<0.05)，二藥聯用上述作用效果更為顯著(P<0.01)。結論EGCG能夠增強紫杉醇對食管癌CaEs-17細胞的化療敏感性，這種作用部分是通過上調P21蛋白實現的。

關鍵詞〔〕食管癌;表沒食子兒茶素沒食子酸酯；紫杉醇；化療

中圖分類號〔〕R735.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：湖北省自然科學基金(2008CDZ022)

通訊作者：鄧守恒(1973-)，男,博士,教授,碩士生導師,主要從事腫瘤藥理研究。

第一作者：袁選舉(1969-)，男,碩士,主治醫師,主要從事腫瘤放化療治療研究。

Effect of epigallocatechin-3-gallate enhancing chemotherapy sensitivity of taxol on human Esophageal Cancer Line CaEs-17 in vitro

YUAN Xuan-Ju,CHEN Ping,WANG Xian-He,etal.

Center of Oncology,People Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) enhancing chemotherapy sensitivity of taxol on human esophageal cancer Line CaEs-17 in vitro and explore its possible mechanism.MethodsThere were four groups:control,EGCG (CaEs-17 cells were pretreated by 20 mg/L EGCG),Taxol (CaEs-17 cells were pretreated by 360 nmol/L Taxol) and EGCG /Tazol groups (CaEs-17cells were pretreated by 360 nmol/L Taxol and 20 mg/L EGCG).After treatment for 24 h,the growth and proliferation of CaEs-17 cell were detected by CCK-8 assay and clone formation test and Jin′s formula was used to assess the synergistic effects between two drugs.Cell apoptosis and phase were detected by the flow cytometry.Cell invasive ability was measured with Transwell.The expression of P21 protein was detected by Western blot.ResultsEGCG,Taxol alone inhibited cell proliferation,induced cell apoptosis,decreased cell survival rate and invasive ability,increased G1 phase cells and down-regulated the expression of P21 in CaEs-17 cells(P<0.05).The effect of Taxol combination with EGCG was better than that of Taxol,EGCG alone(P<0.01).ConclusionsEGCG could enhance chemotherapy sensitivity of taxol on human esophageal cancer Line CaEs-17 in vitro,which is partly related to the up-regulation of P21 protein on tumor cells.

【Key words】Esophageal Cancer;Epigallocatechin-3-Gallate；Taxol;Chemotherapy

紫杉醇作為食管癌常用的化療藥物之一，主要通過促進微管聚合和穩定已聚合微管使細胞分裂停止于有絲分裂期，起到抑制腫瘤細胞增殖的作用〔1〕，然而，骨髓抑制及近年來出現的多藥耐藥等毒副作用限制了其最大療效的發揮。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中含量最高，活性最強的單體〔2〕，已有的研究表明，EGCG可通過誘導細胞凋亡等方式對人鼻咽癌、肺癌、胃腺癌、前列腺癌、大腸癌及白血病等細胞產生明顯的殺傷作用〔3〕。王江江等〔4〕研究還發現，EGCG與一些化療藥物聯用尚能顯著增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，顯示其具有良好的應用前景。EGCG能否增強紫杉醇對食管癌細胞的殺傷作用尚未見有人報道。

1材料與方法

1.1 試藥試劑與儀器EGCG、碘化丙啶(PI)、甲基纖維素(CPS4000)為美國Sigma產品；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司； Transwell小室購自美國Costar公司；兔抗人P21單抗及山羊抗兔的二抗購自美國Santa Cruz公司；其他試劑均為進口分裝分析純。Mod 550型全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)；Mini-Prote電泳儀(美國伯樂公司)；圖像采集系統(日本Olympus公司)；Epics Elite ESP型流式細胞儀(美國Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養食管癌細胞株CaEs-17購自中國科學院上海細胞生物研究所，培養于含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養基內，于37℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養，每2~3 d用0.25%胰酶消化，1∶2傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測單獨及聯合給藥對細胞增殖的影響取指數生長期CaEs-17細胞，以1×105個/孔接種于96孔板，37℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養24 h后吸出原培養液，分為4組，即EGCG組(培養液中EGCG終濃度為20 mg/L)、紫杉醇組(培養液中紫杉醇終濃度為360 nmol/L)、聯合組(培養液中EGCG終濃度為20 mg/L，紫杉醇濃度為360 nmol/L)，另設空白對照組(只加入RPMI1640培養基，未給予其他任何處理),EGCG和紫杉醇取1/2 IC50值，紫杉醇IC50值參照文獻〔5〕，EGCG IC50值參照預實驗結果，繼續培養24 h后，吸去上清液，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續培養1 h，酶標儀檢測各孔在450 nm波長下的吸光度(OD)值，代入公式計算細胞增殖抑制率。增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD度)/對照組OD值×100%。

1.2.3 流式法檢測細胞周期及凋亡細胞分組及處理同1.2.2，收集各組作用24 h細胞，0.01 mol/L PBS0.5 ml重懸細胞，加70%乙醇1 ml，-20℃固定24 h，加入PI (終濃度為50 μl/ml)和RNA酶(終濃度為0.25 mg/ml)，室溫下避光孵育30 min后流式細胞儀作DNA分析，以ModFit LT軟件分析，擬合計算各時相細胞的百分比。

1.2.4 克隆形成法檢測細胞增殖〔5，6〕參照文獻配制半固體培養基，收集經EGCG、紫杉醇單獨和聯合作用24 h的各組細胞， PBS洗去藥物，離心1 000 r/min×3 min，用含20%小牛血清的培養液稀釋成7.0×103個/ml單細胞懸液,于24孔板預加1.2%甲基纖維素培養基1.0 ml/孔，加入單細胞懸液50 μl，使每孔細胞數為350個,每個濃度設4個復孔，混勻后置37℃，5%CO2培養箱中孵育12～14 d后于倒置顯微鏡下計數細胞克隆數，計算細胞存活率(給藥組平均克隆數/未給藥組平均克隆數×100%),實驗重復三次。

1.2.5 Transwell法分析細胞侵襲性改變細胞分組及處理同1.2.2，參照試劑盒說明，以NIH3T3細胞培養液做趨化液，在Transwell上室內加入100 μl不含小牛血清的RPMI1640，37℃孵育1 h，加入上述各組細胞懸液20 μl(調細胞濃度為1.0×105個/ml),每組4個復孔。37℃ 12 h后取出濾膜，甲醇固定，HE染色。顯微鏡下計數濾膜外表面的細胞數，每張濾膜隨機取5個視野(×200)取均值，實驗重復三次，以相對侵襲抑制率表示腫瘤細胞的侵襲力，相對侵襲抑制率(%)=(對照組-實驗組)/對照組×100%。

1.2.6 免疫印跡法檢測P21蛋白表達細胞分組及處理同1.2.2，收集細胞，PBS洗2次，裂解，離心，收集上清，即為細胞總蛋白，進行蛋白定量，調節每份樣品蛋白濃度，加等量蛋白于上樣緩沖液，煮沸，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。電泳后轉膜，依次加入P21蛋白一抗和二抗，加入底物液顯色，拍照。蛋白條帶用Quanti Scan軟件進行密度掃描分析。

2結果

2.1 單獨和聯合給藥對細胞增殖的抑制作用EGCG和紫杉醇單獨作用CaEs-17細胞24 h對細胞產生的增殖抑制率分別為37.5%±2.2%和40.7%±2.8%,二藥合用，則抑制率升高至73.8%±3.8%，合用產生抑制率大于兩藥單獨使用(q=1.16),表明兩藥合用產生的抑制作用遠大于兩藥單獨相加，產生協同效果。

2.2 單獨和聯合給藥對細胞周期分布、凋亡率的影響EGCG和紫杉醇單獨或聯合作用CaEs-17細胞24 h,均可明顯降低S期細胞比例，升高G0-G1期細胞比例，細胞被阻滯于G0-G1期，尤其以聯合用藥組作用效果更為明顯(P<0.01) 。二藥單獨或聯合均可誘導細胞出現凋亡，二藥聯用效果更為顯著(P=0.004、0.001、0.000)(表1)。

2.3 單獨和聯合給藥對細胞存活率及侵襲力的影響EGCG和紫杉醇單獨或聯合作用CaEs-17細胞24 h均可明顯抑制細胞克隆形成，使細胞存活率顯著下降,尤其以二藥合用效果更為顯著(P=0.061、0.056、0.007)。細胞侵襲實驗也顯示出相似的作用結果，表現為與空白對照組比較，經EGCG和紫杉醇單獨或聯合作用后的食管癌細胞穿過基底膜的數量大大降低，二藥合用后效果更為明顯(P=0.084、0.071、0.005)。見表2。

表1　EGCG與紫杉醇單獨和合用對食管癌細胞凋亡和

與空白對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

表2　EGCG與紫杉醇單獨和合用對食管癌細胞

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4 單獨和聯合給藥對細胞P21蛋白表達的影響免疫印跡及灰度掃描結果顯示， 未經處理的空白對照CaEs-17細胞內P21蛋白呈低表達(灰度值為0.301 2±0.09)。經EGCG和紫杉醇單獨或聯合作用24 h后，細胞內P21蛋白灰度值分別升至(0.924 5±0.18)、(0.521 6±0.17)和(1.205 9±0.27),上調率分別為(206.83±21.17)%、(83.21±10.23)%、和(294.36±19.82)%，與空白對照組比較，均有顯著性差異(P=0.000、0.001、0.000)(圖1)。

1，2，3，4分別為EGCG+紫杉醇組、EGCG組、紫杉醇組、空白對照組 圖1　EGCG與紫杉醇單獨和合用對食管癌 細胞P21蛋白表達的影響

3討論

綠茶是我國及東南亞一帶的傳統飲品，綠茶中的主要成分EGCG具有顯著的清除氧自由基、抗氧化、抗衰老、防紫外線、預防心血管疾病等功效〔3〕。近年來，EGCG的抗腫瘤作用逐漸引起了人們的重視，大量體內外試驗表明，EGCG可通過多種途徑對人體多種腫瘤產生明顯的抑制增殖作用，有望開發成一種新的抗腫瘤藥物〔8~10〕。

目前對EGCG抗腫瘤作用的研究多集中在誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期，抑制腫瘤血管生成等方面，而對于EGCG聯合常用化療藥物可否提高腫瘤細胞對化療藥物敏感性及降低化療藥物毒副作用等方面的研究卻較少。本文將EGCG聯合紫杉醇作用于體外培養的食管癌細胞株CaEs-17，采用CCK-8法和克隆形成法檢測其對細胞增殖的影響，結果發現，EGCG、紫杉醇均可明顯抑制細胞增殖，合用還可產生協同效應，抑制效果大于二藥相加。由于克隆形成實驗檢測的是單個細胞的增殖能力，故而從本結果中還可看出， EGCG聯合紫杉醇不僅可對處于增殖期的細胞產生殺傷作用，還可明顯抑制腫瘤干細胞的增殖，這比單純殺死或者抑制癌細胞本身具有更大的價值〔11〕。

腫瘤的發生不僅與細胞增殖失控有關，還與細胞凋亡有關。本研究采用流式細胞法檢測了經EGCG、紫杉醇單獨和聯合作用后的細胞凋亡率并對細胞周期進行了擬合，結果顯示，二藥單獨或聯用均可誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期于G1期，合用上述效果更為顯著。由于細胞增殖的速度主要取決于細胞周期的長短，而細胞周期的長短又主要取決于G1期，G1期阻滯可使細胞增殖周期延長，部分細胞出現凋亡〔12〕。

侵襲是惡性腫瘤的主要特征之一，也是腫瘤復發轉移的重要原因之一。本研究結果顯示，EGCG、紫杉醇均可對食管癌細胞的侵襲能力產生明顯的抑制作用，二藥合用，抑制效果更加顯著，提示EGCG聯合紫杉醇尚能起到降低紫杉醇單藥化療后食管癌細胞易出現的復發轉移等作用。

P21基因是目前已知具有最廣泛活性的細胞周期抑制基因，可對細胞增殖、分化、衰老、凋亡以及損傷修復等過程產生影響〔13〕。研究表明，P21的表達缺失可引起腫瘤的生長失控、更差的分化和預后等，而導入外源P21基因后，上述現象又可得到有效抑制〔14〕。本文經EGCG、紫杉醇單獨和聯合作用后的食管癌細胞中P21蛋白表達出現明顯上調，表明這兩種藥物合用可能就是通過激活P21通路來發揮抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡和阻止細胞侵襲等藥理作用的，但具體的分子機制傷仍需進行深入研究。

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〔2013-12-29修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)