肝康樂對免疫功能低下小鼠的免疫調節作用

肝康樂對免疫功能低下小鼠的免疫調節作用

李鳳袁靜王玉鳳

(安徽中醫藥大學中醫臨床學院，安徽合肥230038)

摘要〔〕目的探討中藥復方肝康樂對免疫抑制小鼠免疫功能的調節作用。方法通過給小鼠腹腔注射免疫抑制劑環磷酰胺復制免疫功能低下的動物模型，然后灌胃給予肝康樂高、中、低劑量，1次/d，連續10 d，分別測定小鼠的脾指數、胸腺指數，巨噬細胞的吞噬功能以及溶血素水平；二硝基氯苯誘導遲發型變態反應(DTH)，觀察肝康樂對DTH的影響。結果肝康樂能夠顯著提高免疫低下小鼠的碳粒廓清率、脾指數、胸腺指數和血清溶血素水平，增強免疫低下小鼠的DTH。結論肝康樂煎劑可以增強免疫低下小鼠的免疫功能。

關鍵詞〔〕肝康樂；特異性免疫；非特異性免疫

中圖分類號〔〕R575〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：安徽省教育廳自然科學基金(No.2006KJ096C)；安徽中醫學院校自然科學基金(No.2012qn009)

第一作者：李鳳(1978-)，女，碩士，講師，主要從事中藥復方藥理與臨床研究。

肝康樂是根據臨床經驗結合現代藥理研究成果創立的方劑，該方精選了黃芪、黨參、丹參、鱉甲、赤芍、柴胡、甘草等中藥，用來治療多種慢性肝臟疾病及肝纖維化。經臨床實踐證實，其對多種慢性肝臟疾病的防治具有較好療效。我們前期實驗曾以復方鱉甲軟肝片作為對照，結果證實肝康樂對免疫損傷性肝纖維化有一定的防治作用〔1〕。本文探討肝康樂對免疫低下小鼠的免疫調節作用。

1材料與方法

1.1動物昆明種小鼠(清潔級)，雌雄兼用，體質量18~22 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:皖醫實動字第009號。豚鼠：購于安徽醫科大學實驗動物中心。

1.2藥物肝康樂復方中各飲片由安徽中醫藥大學國醫堂門診部提供，經安徽中醫藥大學中藥教研室教師鑒定。諸藥水煎煮，3次水煎液混合后濃縮至1、2 g/ml，加苯甲酸鈉防腐，冰箱保存備用。

1.3試劑和儀器環磷酰胺(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號20091002)，印度墨汁(上海長江日用黏合材料廠)，綿羊紅細胞(安徽中醫學院第一附屬醫院檢驗中心提供)。2,4二硝基氯苯(上海試劑一廠生產),UV757CRT紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。4000B型冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.4對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響(碳粒廓清法)〔2，3〕：取小鼠50只，隨機分為五組，分別為正常組、模型組、肝康樂大、中、小劑量組，每組10只。正常組及模型組給予生理鹽水(20 ml/kg)灌胃，肝康樂大、中、小劑量組(49.14，24.57，12.28 g/kg)分別以20 ml/kg不同濃度灌胃，每天1次，連續10 d；從第5天起，除正常組外，每鼠每天腹腔注射環磷酰胺50 mg/kg，每天1次，連續3 d；第10天，末次給藥30 min后，每只小鼠尾靜脈注射按1∶4稀釋的印度墨汁(0.1 ml/10 g)，注射印度墨汁后2、10 min分別從眼眶后靜脈叢取血于玻片上，用微量移液器汲取20 μl血液，吹打入2 ml0.1%Na2CO3溶液，以正常小鼠血加入2 ml 0.1%Na2CO3溶液為空白對照；紫外分光分光光度計650 nm處比色，測定光密度(OD)。小鼠脫頸椎處死，稱取體重、肝、脾質量。分別代入以下公式計算碳粒廓清指數k和吞噬指數α。

1.5免疫器官重量的測定小鼠分組、復制模型及給藥同1.4，末次給藥30 min后，脫頸椎處死小鼠，稱取體重和肝、脾重量，以每小鼠脾重(mg)/體重(g)和胸腺重(mg)/體重(g)作為脾臟和胸腺指數。

1.6小鼠血清溶血素生成的測定〔3〕小鼠按1.4分組，復制模型及給藥，從第4天起，每只小鼠腹腔注射綿羊紅細胞懸液0.2 ml致敏，致敏6 d后，即第10天，眼眶后靜脈叢取血，放血的試管置4℃冰箱過夜，離心，收集血清作800倍稀釋后，吸取0.5 ml稀釋的血清放入另一試管中，依次加入10%SRBC、補體(豚鼠血清)、生理鹽水各0.5 ml，空白管用生理鹽水代替血清，混勻，置37℃水浴30 min后，離心，取上清液，分光光度計540 nm處比色，測OD值；代入以下公式計算血清溶血素含量，HC50=樣本稀釋血清的OD值×稀釋倍數。

1.7對小鼠遲發型變態反應(DTH)的影響小鼠按1.4分組，復制模型及給藥，給藥10 d。參考文獻〔4〕復制DTH模型，實驗第2天用8%的氟化鈉給小鼠腹部脫毛(3 cm×3 cm)，第3天每只小鼠腹部涂抹1%的二硝基氯苯(DNCB)丙酮麻油(丙酮∶麻油=1∶1)溶液20 μl，第6天，同法再次致敏一次，第9天每只小鼠右耳涂抹新鮮配制的1%的DNCB丙酮麻油溶液20 μl進行攻擊，24 h后，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑8 mm打孔器打下圓耳片，稱重，左右耳片之差為腫脹度。

1.8統計學處理采用SPSS11.0軟件進行SNK方法。

2結果

2.1肝康樂對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響與正常組比較，模型組小鼠的碳粒廓清指數k值和吞噬指數α值明顯降低(P<0.01)，提示環磷酰胺已引起小鼠免疫力低下；肝康樂大、中、小劑量組小鼠的α、k值均較模型組顯著升高(P均<0.05)，但與正常組比較仍然偏低(P<0.01)，表明肝康樂均能提高免疫低下小鼠的免疫功能，但不能使之恢復至正常。見表1。

表1　肝康樂對免疫低下小鼠巨噬細胞

與正常組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05,4)P<0.01，下表同

2.2肝康樂對免疫低下小鼠免疫器官重量的影響模型組小鼠的脾臟和胸腺指數較正常組明顯降低(P<0.01)，肝康樂各劑量組脾臟及胸腺指數較模型組顯著升高(P<0.05)，脾臟指數接近正常組(P>0.05)，表明肝康樂可顯著提高免疫低下小鼠的脾臟和胸腺指數，其中，對脾臟的減重恢復較快。 見表2。

表2　肝康樂對免疫低下小鼠免疫器官重量的影響 ± s, n=10)

2.3肝康樂對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響模型組與正常組比較，小鼠血清HC50明顯降低(

表3　肝康樂對免疫低下小鼠血清溶

2.4肝康樂對免疫低下小鼠DTH的影響在DNCB所致的DTH中,模型組小鼠耳腫脹程度較正常組明顯減輕(P<0.01)，肝康樂三個劑量組都能不同程度地增加DNCB致敏后的小鼠耳廓腫脹度(P<0.05),增強免疫低下小鼠的DTH。見表3。

3討論

機體免疫系統是一個復雜、平衡、有機的統一整體，具有嚴密的調控機制。免疫防御、自穩和監視功能構成了機體抵抗外來病原侵襲和維持內環境穩定的重要機制〔5〕。現代醫學對機體免疫功能進行評價主要通過觀察對機體非特異性免疫功能和特異性免疫功能的影響，其中對特異性免疫功能的影響又包括對細胞免疫和體液免疫的影響。當病原體侵入人體時，病原體首先被巨噬細胞與NK細胞識別、殺傷，巨噬細胞釋放細胞因子，引起炎癥反應。巨噬細胞與NK細胞在執行功能時，無嚴格的選擇性，因此它們介導的免疫反應被稱為非特異性免疫。Kupffer細胞是肝臟的巨噬細胞〔6〕。本研究以環磷酰胺誘導免疫低下模型，觀察肝康樂對免疫功能的影響，結果發現：肝康樂各劑量組可明顯提高免疫低下小鼠的碳粒廓清指數k值和吞噬指數α值，大劑量可使k值恢復接近正常組，但不能使α值恢復到正常范圍內。各劑量組可使免疫低下小鼠胸腺及脾臟指數顯著升高，可使脾臟指數恢復接近正常，使機體的細胞免疫和體液免疫功能受到保護；并且可顯著提高免疫低下小鼠血清溶血素水平，使其恢復接近正常水平，提示肝康樂可提高免疫低下小鼠體液免疫功能。DTH是由T細胞介導的免疫應答的一種類型， T淋巴細胞介導的DTH的強弱是反映機體細胞免疫功能的敏感指標之一。肝康樂各劑量組均能夠增強DNCB誘導的遲發型超敏反應,肝康樂具有增強細胞免疫的能力。肝康樂能增強免疫低下機體的免疫功能，使機體抗病能力有所增強，這一作用可能也是肝康樂能夠防治慢性肝臟疾病和肝纖維化的機制之一。由于中藥復方作用的多層次、多靶點、復雜性和不穩定性，其具體作用環節及詳盡機制有待進一步研究。

4參考文獻

1李鳳，胡昊，鳳良元，等.肝康樂抗免疫損傷性肝纖維化的實驗研究〔J〕.安徽醫藥，2009;13(1)：21-2.

2楊海燕，張黎莉.至生膠囊對小鼠免疫功能的影響及其升白作用和抗應激能力的研究〔J〕.中成藥，2010;32(2)：293-5.

3李儀奎，王欽茂.中藥藥理實驗方法學〔M〕.上海：上?？茖W技術出版社，1991：157-8.

4徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學〔M〕.第3版.北京：人民衛生出版社，2002:1433-8.

5Guardia T,Rotelli AE,Juarez AO,etal. Anti-inflammatory properties of plant flavonoids. Effects of rutin,quercetin and hesperidin on adjuvant arthritis in rat〔J〕.Farmaco,2001;56(9):683-7.

6陳慰峰.醫學免疫學〔M〕.第3版.北京：人民衛生出版社，2002:21-40.

〔2014-06-25修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)