再生基因蛋白Ⅳ、骨橋蛋白、表皮生長因子受體蛋白在胃腺癌中的表達及臨床意義

再生基因蛋白Ⅳ、骨橋蛋白、表皮生長因子受體蛋白在胃腺癌中的表達及臨床意義

楊德生康玉華李福春1孫珠蕾2胡軍紅3陳宏超4索智敏

(河南大學淮河醫院消化內科，河南開封475000)

摘要〔〕目的研究再生基因蛋白(Reg)Ⅳ、骨橋蛋白(OPN)及表皮生長因子受體(EGFR)在胃腺癌中的表達及與其臨床意義。方法應用S-P免疫組化技術檢測65例胃腺癌及其相應的癌旁正常組織中RegⅣ、OPN、EGFR蛋白的表達。結果65例胃腺癌組織中RegⅣ、OPN、EGFR蛋白的陽性表達率53.8%(35/65)， 63.1%(41/65)， 56.9%(37/65)均高于癌旁正常組織12.3%(8/65)、4.6%(3/65)、18.5%(12/65)(P<0.05)。RegⅣ蛋白的表達與胃癌分化程度相關有統計學意義(P<0.05)，OPN蛋白的表達與浸潤深度、腫瘤分化程度、臨床分期相關有統計學意義(P<0.05)，EGFR蛋白的表達與胃腺癌的浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期相關有統計學意義(P<0.05)。RegⅣ、OPN與EGFR蛋白在胃腺癌組織中的表達呈正相關關系(P<0.05)，RegⅣ與OPN蛋白在胃腺癌組織中的表達呈正相關關系(P<0.05)。結論RegⅣ、OPN、EGFR蛋白均在胃癌組織中表達呈正相關，并在胃癌的發生發展發揮重要作用。

關鍵詞〔〕再生基因蛋白Ⅳ；骨橋蛋白；表皮生長因子受體；胃腺癌；免疫組織化學

中圖分類號〔〕R735.2〔文獻標識碼〕A〔

1河南大學淮河醫院超聲科2河南大學淮河醫院病理科

3河南大學淮河醫院普通外科4鄭州市第一人民醫院消化內科

第一作者：楊德生(1981-)，男，碩士，主治醫師，主要從事消化道腫瘤研究。

胃癌是病死率僅次于肺癌，在中國的發病率正在逐年上升的趨勢〔1~3〕，其中絕大多數為胃腺癌。盡管已有治療研究取得重大進展，但仍不能令人滿意，胃腺癌的5年生產率仍然很低。胃癌治療方面研究的突破取決于胃癌的復雜的分子機制等基礎研究的進展〔4〕。研究發現多種基因和表觀遺傳學的改變在胃癌的發生發展中發揮重要作用，比如粒酶活性，遺傳不穩定性、原癌基因、抑癌基因、生長因子、基質降解酶、細胞周期調控蛋白、細胞黏附分子等〔5~7〕。再生基因蛋白(Reg)基因家族是鈣依賴性凝集素超家族〔1,2〕，在一些胃腸道腫瘤中表達上調，參與細胞增殖和分化，RegⅣ是其中一個新成員〔3,8〕。骨橋蛋白(OPN)是在最初骨基質中發現的，具有多種功能的一種胞外基質蛋白，參與細胞黏附和細胞遷移，影響腫瘤發生和轉移進程〔9〕。表皮生長因子受體(EGFR)為酪氨酸激酶受體，在體內通過多種信號途徑在腫瘤的發生發展中發揮重要作用〔10〕。在胃腺癌中EZH2與EGFR、Akt的蛋白水平的表達之間的關系國內外未見報道。因此，本研究采用免疫組織化學染色法檢測RegⅣ、OPN、EGFR蛋白在胃癌及癌旁正常組織中的表達，為闡明其與胃癌的關系，探討RegⅣ、OPN、EGFR蛋白在胃癌中的作用及潛在的作用機制。

1材料與方法

1.1標本來自河南大學淮河醫院普通外科2010年1月至2011年6月手術切除新鮮胃腺癌標本 65例，均經HE切片病理證實，所有病例術前均未接受任何放療或化療，并排除其他臟器的惡性腫瘤。選取同一病例的癌旁切緣正常組織65例作為對照組。65例胃腺癌中，男34例，女31例；年齡27~79〔平均(46.3±4.5)〕歲；高、中、低分化腺癌分別為16例、22例和27例；淋巴結轉移44例，無轉移21例；按TNM分期標準，Ⅰ期9例，Ⅱ期15例，Ⅲ期19例及Ⅳ期22例；按浸潤深度分，T110例，T215例，T317例， T423例。

1.2試劑及方法濃縮型鼠抗人單克隆抗體RegⅣ、OPN、EGFR及免疫組化試劑盒、DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。用免疫組化(S-P 法)法：取厚4 μm石蠟切片，常規脫蠟、水化后，采用電爐加熱煮沸修復抗原；RegⅣ、OPN、EGFR蛋白單克隆抗體均按1∶100稀釋，操作參照產品說明書，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。用已證實的RegⅣ、OPN、EGFR染色陽性胃腺癌切片作陽性對照。

1.3結果判斷RegⅣ、OPN、EGFR蛋白均按照以下標準：根據染色程度及陽性細胞數來計算評分，a 染色程度:0陰性，1弱陽性，2中等陽性，3強陽性；b 陽性細胞數:無陽性細胞0，陽性細胞1%~25% 1分，陽性細胞26%~50% 2分，陽性細胞>50% 3分；a+b之和為3~6分者評為免疫組織染色陽性；計數方法，結果判定在雙盲法下進行，每張切片由兩名病理醫師分別判斷。兩者不一致時重新計數。

1.4統計學方法應用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗、非參數檢驗的秩和檢驗，雙變量相關關系分析采用Spearman相關分析。

2結果

2.1RegⅣ、OPN、EGFR蛋白的表達 65例胃腺癌組織中，RegⅣ蛋白陽性表達率53.8%(35/65)，其陽性表達部位為細胞核；OPN的陽性表達率63.1%(41/65)，陽性表達部位為主要在細胞質；EGFR的陽性表達率56.9%(37/65)，陽性表達部位為細胞膜，均呈強陽性過度表達現象。癌旁正常組織中，RegⅣ、OPN、EGFR蛋白均為弱陽性低表達，陽性表達率分別為12.3%(8/65)、4.6%(3/65)、18.5%(12/65)。兩組間表達差異有統計學意義(χ2=25.333、49.609、20.471，P=0.00)。見圖1。

2.2Reg Ⅳ、OPN、EGFR蛋白的表達與胃腺癌的臨床病理特征的關系Reg Ⅳ蛋白的表達與胃癌分化程度相關有統計學意義(P<0.05)，與淋巴結轉移程度、臨床分期及浸潤深度無關(P>0.05);OPN與EGFR蛋白的表達與胃腺癌的浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期相關有統計學意義(P<0.05)，與腫瘤分化程度無關(P>0.05)。見表1。

表1　RegⅣ、OPN、EGFR蛋白陽性表達與

2.3RegⅣ、OPN、EGFR蛋白在胃腺癌中表達之間的相互關系RegⅣ、OPN與EGFR蛋白在胃腺癌組織中的表達呈正相關(r=0.254,P=0.041;r=0.300,P=0.015)，RegⅣ與OPN蛋白在胃腺癌組織中的表達呈正相關(r=0.251,P<0.05)。

RegⅣ

OPN

EGFR

3討論

Reg代表一組小的細胞再生和增殖所必需的分泌蛋白，形成一種免疫系統〔11,12〕。人的Reg家族中，人RegⅣ基因位于1號染色體上，不像其他Reg家族基因均位于2p12〔13〕。RegⅣ可在各種正常組織表達，如胃、大腸、小腸和胰腺〔14,15〕，但其表達水平較癌組織中要低得多〔16〕。Violette等〔17〕的研究表明，Reg Ⅳ在大腸腫瘤(特別是在黏液癌)相對于正常大腸組織。一些研究已經證明，在胃癌組織中高表達RegⅣ蛋白。Bishnupuri等〔18〕報道，用定量聚合酶鏈反應(PCR)測定，胃癌中RegⅣ基因的表達顯著高于正常組織。RegⅣ的抗凋亡特性與大腸癌的進展和胃癌化療耐藥性密切相關〔18,19〕，RegⅣ的表達有望成為一個標記高度惡性潛力的生物學標志物〔15，20，21〕。Oue等〔14〕用免疫組織化學法檢測發現，結直腸腺癌RegⅣ蛋白36%高表達，且與腫瘤分期密切相關，而在29%的胃腺癌中高表達，并伴有腸黏蛋白表型和神經內分泌分化，但與腫瘤分期和預后無相關。本研究發現，RegⅣ在胃腺癌中高表達，顯著高于癌旁正常組織中的表達，且腫瘤分化程度相關，而與臨床分期、淋巴轉移、浸潤深度無關，與文獻報道相符，進一步證實了RegⅣ在胃腺癌中的作用。

EGFR是一種跨膜蛋白，屬于ErbB家族受體酪氨酸激酶(RTK)。它被激活后與EGF家族的肽生長因子結合，其中包括表皮生長因子(EGF)，轉化生長因子(TGF)-α等〔22,23〕，通過與配體結合誘導ErbB受體聚合物和異二聚體，導致細胞質的激酶結構域的酪氨酸激酶自身磷酸化和激活。激活EGFR結果同時激活多個下游信號轉導通路調制的多效性細胞的反應，包括細胞增殖，遷移，侵襲，抑制細胞凋亡〔24〕。本研究發現，EGFR在胃腺癌中高表達，顯著高于癌旁正常組織中的表達，且與臨床分期、淋巴轉移、浸潤深度相關，而與腫瘤分化程度無關，與文獻報道相符〔25〕，進一步證實了EGFR在胃腺癌中的作用。

OPN首先被確定為一個非膠原骨基質蛋白，它隨后被證明是一種細胞因子，調節免疫細胞的移動〔26〕。此外，OPN作為腫瘤侵襲和轉移中的一個關鍵的信號調節通路在乳腺癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌和結腸癌中被證實〔27,28〕的。OPN可綁定到不同的細胞表面受體，包括整合素等，誘導并影響腫瘤細胞的基因表達，增強的移動性和黏附，加速生長和分裂，以及延長細胞的存活，從而腫瘤進展和轉移的過程中發揮重要作用〔29,30〕。OPN最近被認為是腫瘤進展〔31〕的一個新的標志物。OPN的高表達水平與腫瘤分期，轉移及患者生存期密切相關〔32〕。在本研究中骨橋蛋白表達于細胞質，在胃腺癌中的陽性率顯著高于癌旁正常組織，且其表達與腫瘤的淋巴轉移、浸潤深度、臨床分期相關，這與目前文獻報道相符〔33,34〕。

RegⅣ激活的信號轉導通路知之甚少。EGFR在MKN28和TMK1細胞中形成自分泌和旁分泌環路〔35〕。據報道，高磷酸化水平的表皮生長因子受體和RegⅣ在MKN28和TMK1細胞系中，RegⅣ與EGFR的高磷酸化水平與EGFR的磷酸化有關〔36〕。Kuniyasu等〔37〕研究發現在RegⅣ轉染MKN28和TMK1胃癌細胞系中可增加的EGFR磷酸化水平。在RegⅣ轉染的MKN28和TMK1細胞系中，RegⅣ可增加EGFR的磷酸化。在敲除RegⅣ的MKN45細胞中，反比抑制表皮生長因子受體磷酸化表達。Bishnupuri等〔36〕通過觀察結腸腺癌細胞純化rhR4對的信號傳導通路響應Reg Ⅳ的影響，得出rhR4治療導致EGFR酪氨酸992和Tyr 1068和Akt蛋白在蘇氨酸308和絲氨酸473的快速磷酸化，推測在人結腸癌細胞系RegⅣ蛋白是一種強效的EGFR/磷酸肌醇3-kinase/Akt/AP-1的信號轉導通路激活劑。激活EGFR信號傳導通路在結腸癌細胞的有絲分裂信號，增加細胞增殖，血管生成，轉移和抗細胞凋亡〔38〕。Nanakin等〔39〕發現，在SW403細胞系中EGF和TGF-α可增強RegⅣ基因表達的ERK信號通路。兩者合計，這些研究表明，陽性表達EGF和RegⅣ之 間存在反饋回路中的信號通路。因此，阻斷RegⅣ/EGFR信號傳導可作為人胃腸腺癌的潛在的治療干預措施。本研究發現，RegⅣ和EGFR在胃腺癌中的表達呈正相關，進一步從蛋白水平證實了上述觀點。

EGFR和OPN之間的相互作用，在體外的一些實驗性腫瘤系統已被證明，但是，也有沒有報告其在對人的活檢組織體內實驗中報道較少。研究發現，由EGF通過與受體結合可以在乳腺癌細胞，大鼠腎上皮細胞〔40〕，HepG2細胞〔41〕，和HL60細胞〔42〕中誘導骨橋蛋白基因的表達〔43〕。在另一方面，在對乳腺癌細胞的體外研究表明，腫瘤細胞中的下游信號轉導途徑的激活導致了與整合結合的OPN誘發的c-Src的依賴性的EGFR的轉錄〔29〕。EGFR酪氨酸激酶信號途徑可被內在受體終止。整合素和生長因子受體各種激活和抑制信號的平衡被認為可以確定細胞的命運。然而，整合素和生長因子受體之間的相互作用比簡單的獨立激活相同的信號通路更復雜〔44〕。在缺乏配體如EGFR的情況，整合素所誘導多種受體酪氨酸激酶激活都將被中斷。在細胞的生長和延長細胞的存活，蛋白質水解等生物學效應方面，骨橋蛋白和表皮生長因子受體配體結合和Akt的活化的信號途徑是重疊的〔45〕。

癌癥的發生發展是多個基因的相互作用的結果。更好地了解發生癌變過程中基因表達的變化，可用于腫瘤的診斷，治療和預防。新的生物標志物對癌癥診斷和治療的新靶點鑒定的一個主要目標〔46〕。本研究顯示，RegⅣ、OPN、EGFR在胃腺癌組織中高表達，且其表達呈正相關，提示三者在胃癌的發生發展中呈潛在的相互協調作用，聯合監測3個指標有望對胃腺癌的早期診斷、靶向治療和預后評估提供參考，Reg Ⅳ、OPN、EGFR在胃腺癌中的具體作用機制還有待進一步實驗證明。

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〔2013-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)