決明子對便秘小鼠結腸肌電和水通道蛋白3表達的影響

決明子對便秘小鼠結腸肌電和水通道蛋白3表達的影響

劉旭杜愛林1姜洪波2陳亞云1張小艷1楊社敏1張瑞嶺1劉曉麗1

(新鄉醫學院三全學院，河南新鄉453003)

摘要〔〕目的探討決明子對慢傳輸型便秘小鼠結腸肌電活動和水通道蛋白3(AQP3)在結腸黏膜表達的影響。方法40只雄性小鼠隨機分為四組，對照組、便秘組、決明子組和酚酞組(陽性對照組)。建立小鼠慢傳輸便秘模型，用決明子，酚酞灌胃治療決明子組和酚酞組。檢測4組小鼠首便時間，6 h排便數量，結腸肌電信號，結腸黏膜AQP3的表達。結果決明子組與便秘組相比，首便時間縮短，6 h糞便數量增加(P<0.05)，結腸肌電慢波頻率振幅均有極顯著差異(P<0.01)，頻率變異系數有顯著差異(P<0.05)，結腸黏膜AQP3平均光密度有極顯著差異(P<0.01)。結論決明子能夠有效地改善小鼠結腸運動功能，減少結腸黏膜AQP3的表達，對慢傳輸型便秘治療具有顯著療效。

關鍵詞〔〕便秘；結腸；肌電；水通道蛋白3

中圖分類號〔〕R337.4〔文獻標識碼〕A〔

項目基金

通訊作者：劉曉麗(1968-)，女，高級實驗師，主要從事結腸肌電生理研究。

1新鄉醫學院2新鄉醫學院第三附屬醫院

第一作者：劉旭(1990-)，女，本科在讀，主要從事臨床醫學研究。

Effects of Semen Cassiae on colonic myoelectrical activity and AQP3 in mice

LIU Xu，DU Ai-Lin，JIANG Hong-Bo,etal.

Sanquan College of Xinxiang Medical University， Xinxiang 453003,Henan,China

Abstract【】ObjectiveTo study Semen Cassiae on the colonic myoelectrical activity and the effect of the expression of aquaporin-3(AQP3) in the colonic mucosa of mice with slow transit constipation.Methods40 male mice were randomly divided into:control,constipation,Semen Cassiae and phenolphthalein groups(positive control group).The compound diphenoxylate tablets for intragastric mice was used to establish mice model of slow transit constipation,and then the Semen Cassiae,and phenolphthalein were given by intragastric administration to treat the mice of Semen Cassiae group and phenolphthalein group,respectively.The constipation group were orally administered with the same volume of distilled water.The bowel transit function was measured by eosin propulsion test and the first defecation time and the number of red stool in the initiative 6 hours were recorded.BL-420F system was used for collecting change of myoelectrical signals of the mice colon.Immunohistochemical was used to detect the expression of AQP3 in colon mucosa of mice.ResultsThe effect of Semen Cassiae on the first defecation time and the number defecation of red stool in the initiative 6 hours had obviously changed.The grain number of red stool in 6 hours of constipation group was less than that of control group,associated with prolong of the first defecation time (P<0.01).Compared with constipation group,Semen Cassiae group and phenolphthalein group shortened the first defecation time and increased the grain number of the defecation red stool in 6 hours of the mice (P<0.05).The constipation group of colonic myoelectrical activity of mice slow-waves frequency was (7.78±1.59) Hz,slow-waves amplitude was (0.06±0.01) mV,and the Semen Cassiae group of slow-waves frequency was (3.32±0.55)Hz,slow-waves amplitude was (0.07±0.02) mV.Compared with the constipation group,there were all significant differences (P<0.01).Compared with the Semen Cassiae group 〔(12.49±0.99)%〕,c slow-waves frequency variation coefficient of constipation group was significantly increased 〔(21.09±2.40)%,P<0.01〕.There was no significant difference in the slow-waves amplitude variation coefficient between constipation and Semen Cassiae groups(16.91%±8.45%,vs 15.75%±4.09%,P>0.05).There was significant difference in the expression of the mean optic density of AQP3 in colonic mucosa between constipation and Semen Cassiae groups(0.23±0.02 and 0.15±0.01,P<0.01).ConclusionsSemen Cassiae could improve motor function in mice colon,reduce expression of AQP3 in colon mucosa,and has significant effects on the treatment of slow transit constipation.

【Key words】Constipation;Colon;Myoelectrical;AQP3

便秘會因體內有害物質不能及時排除，從而引起腹脹、噯氣、胃酸、中毒的反應，導致腸道生態平衡失調，增加大腸癌發生的危險〔1〕。慢性便秘還可誘發老年癡呆癥、心腦血管疾病、腦血管意外、心肌梗死等嚴重疾病。同時，便秘還是多種疾病的并發癥。目前臨床常用來治療便秘的藥物多具有依賴性，副作用明顯，刺激性大。而決明子作為一種藥食同源品種，具有刺激性小，服用方便，價格便宜等優點。目前普遍認為蒽醌類是決明子起瀉下作用的主要成分，但對決明子治療慢傳輸型便秘的作用機制尚未完全清楚，因此，本研究利用結腸肌電和免疫組織化學技術，探討慢傳輸型便秘小鼠結腸肌電活動和結腸黏膜AQP3表達的影響。

1材料與方法

1.1動物48只雄性昆明小鼠，體質量為20~25 g，由新鄉醫學院實驗動物中心提供。按體重隨機分為4組，對照組、便秘組、酚酞組、決明子組，每組6只。

1.2主要試劑復方地芬諾酯片(河南鼎昌藥業有限公司，批號：12060701)，酚酞片(山西亨瑞達制藥有限公司，批號：130106)，曙紅Y來源于上海永綠生物有限公司(CAS 號:17372-87-1)，決明子(新鄉市同仁堂藥房提供)，一抗兔抗鼠單抗AQP3，(北京博奧森生物有限公司，Lot:980590W)，兔SP檢測試劑盒(北京中杉金橋有限公司，批號：13152A04)，磷酸鹽緩沖液(PBS 0.01 mol/L，pH7.2~7.4)，DAB顯色試劑盒ZLI-9018(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：K1352222E)等。

1.3主要儀器BL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)，自制銅絲電極直徑0.5 mm，長度4 mm。

1.4造模每天中午12時，除對照組外，其余三組小鼠均灌胃復方地芬諾酯片25 mg/kg〔2〕，對照組灌胃等體積蒸餾水。決明子組和酚酞組每天下午18：00，分別灌胃決明子3 g/kg(按小鼠用藥量是成人9倍計算，決明子研磨成粉沸水沖泡冷卻至室溫時灌胃〔3〕)，酚酞30 mg/kg，其他組灌胃等體積蒸餾水，除對照組外，其他組均限水。連續造模1 w。1 w后，四組小鼠均按照10 mg/kg灌胃曙紅懸濁液，然后觀察并記錄小鼠首便時間和最初6h紅便數量。

1.5結腸肌電測定用BL-420F生物機能實驗系統進行肌電測定，具體方法參照盧智敏等〔4〕描述，靈敏度選擇:增益2 mV，時間常數3 s，高頻濾波為10 Hz，連續記錄1 h左右。將每組的記錄結果5 min作為一個時間段，分別計算出每一時間段的頻率和振幅的均值、標準差及變異系數，再取各組均值、標準差及變異系數進行比較。慢波頻率變異系數(%)=慢波頻率標準差/慢波頻率均值×100%。慢波振幅變異系數(%)=慢波振幅標準差/慢波振幅均值×100%。

1.6免疫組織化學技術造模完成后，四組小鼠禁食24 h，20%烏拉坦腹腔注射麻醉(5 mg/kg)，取小鼠結腸近段進行常規固定，脫水，石蠟包埋，切片，切片厚度7 μm。常規免疫組織化學技術染色(其中二抗濃度為1∶150)每次試驗以酚酞組作為陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照，光學顯微鏡下觀察AQP3的表達情況，以細胞中出現明顯的棕褐色顆粒為陽性細胞，在400倍光鏡下選擇5個完整不重疊視野，用Image pro-Plus6.0軟件分析每個視野平均光密度值。

1.7統計學方法采用SPSS11.0進行t檢驗。

2結果

2.1糞便性質的改變便秘組、決明子組和酚酞組小鼠糞便比對照組粒小、干燥、質硬。便秘組與對照組相比，首粒紅便時間顯著延長(P<0.01),便秘組6 h紅便粒數少于對照組(P<0.01)。決明子組與便秘組相比首粒紅便時間縮短(P<0.05)，便秘組6 h紅便粒數與決明子組相比，決明子組6 h紅便粒數顯著增加(P<0.05)。酚酞組首粒糞便時間與便秘組相比顯著縮短(P<0.05)，便秘組6 h紅便粒數與酚酞組相比顯著減少(P<0.05)。見表1。

2.2結腸黏膜AQP3表達情況AQP3陽性表達為棕褐色顆粒，結腸黏膜AQP3主要分布在吸收細胞和杯狀細胞基底側細胞膜及靠近基底部的細胞質和細胞頂部。對照組AQP3主要表達于吸收細胞，杯狀細胞表達較少。便秘組吸收細胞和杯狀細胞幾乎都有AQP3表達，染色較深。決明子組、酚酞組與便秘組相比AQP3表達主要以吸收細胞為主，表達較少。對照組AQP3表達的平均光密度值為0.147±0.014，便秘組為0.235±0.023，便秘組AQP3表達強度明顯高于對照組(P<0.01)，決明子組AQP3表達的平均光密度值為0.153±0.014，便秘組明顯高于決明子組(P<0.01)，酚酞組AQP3表達的平均光密度值為0.179±0.010，便秘組明顯高于酚酞組(P<0.01)。見圖1。

表1　四組小鼠排便情況比較

與便秘組比較：1)P<0.01,2)P<0.05，下表同

圖1　四組小鼠結腸上皮細胞AQP3的免疫組化 染色表達(DAB，×400)

2.3 結腸肌電活動四組小鼠的結腸慢波表現近似于正弦波樣曲線。對照組慢波頻率、振幅規律。便秘組慢波波形不規則，慢波頻率、振幅較不規律。決明子組和酚酞組慢波表現有不明顯雙峰，慢波頻率、振幅較規律。見圖2。與對照組比較，便秘組慢波頻率加快(P<0.01)，慢波振幅減小(P<0.01)。與對照組比較，便秘組慢波頻率變異系數較大(P<0.01)，兩組慢波振幅變異系數比較無顯著差異(P>0.05)。與決明子組相比，便秘組慢波頻率加快(P<0.01)，慢波振幅減小(P<0.01)。

圖2　四組小鼠的慢波波形

與決明子組相比，便秘組慢波頻率變異系數較大(P<0.05)，兩組慢波振幅變異系數比較，無顯著差異(P>0.05)。與酚酞組比較，便秘組慢波頻率加快(P<0.01)，慢波振幅減小(P<0.01)。與酚酞組比較，便秘組慢波頻率變異系數比較(P<0.05)。兩組慢波振幅變異系數比較減慢，無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2　四組小鼠的慢波頻率和振幅比較 ± s, n=6)

3討論

傳統中醫學認為決明子性味甘苦，咸微寒，入肝經、大腸經。主要功效為清肝、明目、潤腸通便。決明子在治療便秘方面效果顯著，后遺癥低、并發癥低、不良反應小，常應用在便秘的臨床治療中〔5〕。經現代醫學研究證明決明子在降壓、降脂、保肝、抗氧化等方面也有一定療效〔6〕，擁有諸多優點，應被廣泛推廣使用。

慢波是相對規律的一種周期性電活動，控制著腸道收縮節律，無論收縮與否始終存在〔7〕。結腸肌電動作電位產生于慢波之上，與平滑肌收縮一致，是結腸推進性運動的主要動力，所以，結腸慢波的頻率和振幅也就可以作為反映結腸功能的一項客觀電生理指標〔8〕。本實驗表明決明子在一定程度上可以恢復慢傳輸型便秘小鼠慢波頻率、振幅，減小頻率變異系數，提示恢復慢傳輸型便秘小鼠結腸慢波的頻率和振幅是決明子治療慢傳輸型便秘的機制之一。

AQPs廣泛存在于人體的各個器官組織細胞中，是一種可使水通過漿膜的膜蛋白家族，AQP3是水通道蛋白家族中的一個亞型，AQP3主要在結腸表達〔9〕，在結腸內容物水的調節中發揮重要作用，抑制結腸內AQP3的功能將導致腹瀉〔10〕。結腸黏膜AQP3主要分布在細胞基底側及腔面細胞質〔11〕，其主要功能是將腸腔內的水從基底側轉移到細胞間隙中。因此，結腸黏膜內AQP3表達強度和功能與結腸內水分的多少有關，從而對便秘的形成，具有一定影響。本實驗結果說明便秘小鼠經決明子治療后AQP3表達強度減弱。由此，可能提示決明子治療慢傳輸型便秘的機制之一是通過下調結腸黏膜AQP3的表達，增加腸道水分，起到潤滑腸道內容物的作用。

腸道神經系統主要的抑制性遞質是血管活性腸多肽(VIP)。VIP是廣泛存在的腦腸肽，在消化系統中十二指腸和結腸含量最高〔12〕，能松弛腸道平滑肌，對胃腸運動起抑制性調節作用。有研究指出，蔥醌類物質能顯著提高糖尿病大鼠血漿的VIP水平，從而使糖尿病所致的胃腸推進功能減退〔13〕。本實驗中決明子可能通過其蒽醌類物質作用于VIP，增加結腸推進功能，緩解便秘，而其推進功能的提高可能經慢波頻率和振幅的顯著增加的形式來表現。Itoh等〔14〕研究發現VIP通過cAMP依賴的途徑上調AQP3 mRNA和蛋白表達，推測VIP參與便秘發生與上調AQP3的表達。本實驗中決明子組AQP3的表達減少提示決明子可能通過調節結腸VIP的含量，下調AQP3的表達，減少結腸內水分的吸收，減輕腸壁水腫，提高腸黏膜敏感性，增大的腸道內容物體積，刺激腸黏膜，增加腸道蠕動，而緩解小鼠慢傳輸型便秘。

4參考文獻

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〔2014-07-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)