缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注后周細胞的影響

缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注后周細胞的影響

韓冬孫淼張進1何平平張鴻馮娟

(中國醫科大學附屬盛京醫院神經內科，遼寧沈陽110004)

摘要〔〕目的探討缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注后周細胞變化的影響。方法30只Wistar雄性大鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注組(I/R組)和缺血后處理組(IP組)。采用線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血模型，腦缺血2 h后IP組給予缺血后處理。于腦缺血再灌注后24 h行TTC染色觀察腦梗死體積測定，應用透射電鏡觀察周細胞結構的微觀變化，行各組間比較。結果IP組腦梗死體積明顯小于I/R組;I/R周細胞胞體腫脹，呈橢圓形，壓迫微血管，管腔明顯變小，IP組周細胞腫脹減輕，微血管管腔輕度狹窄；I/R組周細胞與基底膜部分分離，IP組周細胞貼敷于基底膜外周。結論缺血后處理可減小大鼠腦缺血再灌注后減小梗死體積，減輕因周細胞改變導致的管腔變小及抑制周細胞遷移，具有神經保護作用。

關鍵詞〔〕缺血后處理；周細胞；神經血管單位；缺血/再灌注

中圖分類號〔〕R743.3〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：遼寧省博士科研啟動

通訊作者：馮娟(1965-)，女，主任醫師，博士生導師，主要從事腦血管疾病研究。

1吉林大學第一醫院風濕科

第一作者：韓冬(1978-)，男，副教授，博士，主要從事腦血管疾病研究。

缺血性腦血管病是臨床的常見病和多發病。腦缺血發生后，血腦屏障(BBB)遭到破壞，導致腦水腫、大分子物質進入腦組織、甚至發生出血轉化。BBB由內皮細胞、基底膜、周細胞及星形膠質細胞終足組成。其中周細胞位于內皮細胞和基底膜外，包繞于微血管周圍，分布廣泛，在腦中周細胞與內皮細胞數量比例大約為1∶3。以前觀點認為周細胞僅是支持細胞，但越來越多研究證實，周細胞還具有調節腦微循環血流〔1〕、維持血腦屏障穩定性〔2〕以及促進內皮細胞緊密連接形成〔3〕、吞噬和抗原呈遞作用以及多能干細胞功能〔4〕等作用。腦缺血后處理〔5〕是指在缺血再灌注后一定時間內，給予1次或多次短暫性缺血再灌注，使腦組織對前面較長時間的缺血產生耐受。Zhao等〔6〕于2006年首先發現缺血后處理的神經保護作用，可以減小腦梗死體積，減輕神經功能損傷，抑制細胞凋亡。本實驗采用線拴法制備大鼠局灶性腦缺血模型，電鏡觀察周細胞微觀形態改變，探討缺血后處理對缺血再灌注后周細胞變化的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組雄性清潔級Wistar大鼠，體重250～280 g，由中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供。動物隨機分為假手術組(Sham)組，缺血再灌注組(I/R)組和缺血后處理組(IP)組，每組10只動物。

1.2動物模型采用Longa法〔7〕制作大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型適當改良后進行。建立大腦中動脈阻塞(MCAO)再灌注模型。術中用電熱毯及電烤燈保持大鼠肛溫在36℃~37℃，術后分籠飼養。Sham組：栓線插入深度為10 mm，使栓線頭端停留于頸內動脈內而不進入大腦中動脈內。I/R組：缺血120 min后，將大鼠再次麻醉，將栓線抽出，實現大腦中動脈血流再通。IP組：在缺血120 min后，拔出5 mm栓線，使血管再通30 s，然后再將栓線插入5 mm，阻斷血流30 s，如此進行3個循環，進行缺血后處理。之后拔出栓線實現永久再灌注。所有大鼠于再灌注24 h處死取材。

1.3腦梗死體積測定TTC染色：腦切成2 mm厚，放于2%TTC染液中，37℃溫育15 min。正常腦細胞染成橘紅色，梗死區不著色，用圖像處理軟件(Acrobe，photoshop5.0)計算梗死面積(橘紅色區域為正常腦組織，白色區域為梗死區)、各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)為總的梗死容積。梗死體積百分率=(正常側大腦半球體積-梗死側非梗死區腦組織體積)/正常側大腦半球體積×100%。

1.4電鏡切片的制備和觀察大鼠腦缺血再灌注24 h后迅速斷頭取腦，取1×1×1 mm3大小的新鮮腦組織，放入2.5%戊二醛中浸泡固定，2%四氧化鋨后固定，梯度酒精脫水，環氧樹脂618包埋、超薄切片經醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色后，在80 kV條件下用JEM-1200EX型透射電鏡觀察結果。

1.5統計學方法采用SPSS13.0軟件進行q檢驗及t檢驗。

2結果

2.1缺血后處理對大鼠梗死體積的影響TTC染色結果顯示，Sham組未見梗死灶，見圖1。I/R組和IP組右側大腦半球可見白色腦梗死灶，I/R組和IP組梗死體積百分比分別為29.92%±5.57%和20.99%±4.66%，IP組梗死體積百分比明顯小于I/R組(P<0.05)。

2.2缺血后處理對MCAO大鼠周細胞遷移的影響Sham組周細胞細胞核扁圓形，緊貼于基底膜外壁，基底膜規整； I/R組周細胞明顯腫脹，細胞收縮呈橢圓形，導致微血管管徑變小，管腔變窄，基底膜紊亂，緊密連接開放，周細胞與基底膜分離；而IP組周細胞腫脹較I/R組減輕，管腔輕度狹窄，緊密連接未開放，周細胞仍貼于基底膜外壁，見圖2。

圖1　腦缺血2 h再灌注24 h腦梗死大體觀察

圖2　缺血2 h再灌注24 h后周細胞變化(×10 000)

3討論

目前神經血管單元是腦缺血再灌注后神經保護的熱點。神經血管單元是由Lo等〔8〕于2003年提出的概念模型，它由神經元、BBB(包括星形膠質細胞足突，微血管內皮細胞，基底膜及周細胞等)、小膠質細胞及維持腦組織完整的細胞外基質組成，是神經系統結構和功能單位。神經血管單元重點在于強調整體，而不是單一某一細胞，其中各個成分之間存在密切關系，相互影響、相互依存。缺血后處理對于腦缺血再灌注損傷具有一定的神經保護作用〔9~11〕，可以減小腦梗死體積，減輕神經功能損傷，與本實驗觀察到的缺血后處理的神經保護作用相同。我們在以前的實驗中證實了缺血后處理對缺血再灌注后的神經-血管單元具有一定保護作用〔12〕。

BBB是神經血管單元的核心結構，BBB中的任何一種成分受損都會影響到其他成分，所以周細胞的改變也直接影響BBB的其他成分及其功能。周細胞包繞于微血管外周，大量表達一種與血管平滑肌細胞相同的收縮蛋白——α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)。在正常情況下，周細胞可通過這種蛋白的動態收縮和舒張控制微血管管腔大小變化來控制微血流的變化〔13〕。在腦缺血再灌注發生后，產生大量的活性氧自由基、細胞內鈣超載〔14，15〕及氧化物——亞硝基〔16〕，這些物質可以刺激周細胞持續過度收縮α-SMA，進一步加重微循環障礙。Dalkara等〔17〕研究發現，在局灶性MCAO模型中，周細胞的收縮發生在大腦中動脈閉塞期間及血流恢復以后一段時間。本文電鏡觀察證實了腦缺血再灌注后周細胞形態改變，細胞收縮，導致微血管管徑變小，進一步加重腦缺血。而缺血后處理能夠抑制周細胞的這種收縮作用，從而減輕了周細胞對微血管的影響。

在體外內皮細胞、周細胞及星形膠質細胞混合培養的BBB模型中，在缺氧條件下，單層內皮細胞滲透性增加，而周細胞則可以減弱這種滲透性，說明周細胞有助于維持內皮細胞功能。而且，當內皮細胞與周細胞共同培養時，可以降低內皮細胞對缺氧的敏感性〔18〕。周細胞可以表達的TGF-β1和AP-1以及分泌的Ⅳ型膠原蛋白、層黏連蛋白、透明質酸有關，前者參與維持BBB的緊密連接，后者參與基底膜的形成〔3〕，所以周細胞對于BBB穩定性的維持有重要作用。Duz等〔19〕在大鼠MCAO模型中超微結構研究中發現，在缺血早期，周細胞從血管壁分離，微血管基底膜結構紊亂，而且周細胞與緊密連接關系密切，這種結構的改變可能導致BBB通透性增高，所以周細胞在缺血早期的遷移加重BBB功能損害，我們在電鏡中也發現了腦缺血再灌注后周細胞與血管壁分離、緊密連接開放、基底膜紊亂的現象，而缺血后處理則能夠減輕這種分離現象，同時抑制緊密連接開放及減輕基底膜紊亂，起到對BBB的保護作用。有實驗證實了缺血后處理可以減輕缺血再灌注后BBB的通透性升高〔19，20〕，而缺血后處理對周細胞的保護可能是其對BBB起到保護作用的機制之一。

缺血后處理對周細胞的保護作用機制目前還不完全清楚。在體外研究中〔21〕發現周細胞能夠釋放MMP-9，MMP9可以刺激周細胞遷移，從而導致BBB受損。而MMP-9在腦缺血后表達明顯增加〔22〕，缺血后處理可以減少MMP-9的表達〔23〕，從而抑制了周細胞在缺血再灌注后的遷移，保持BBB結構和功能的完整。總之，在腦缺血再灌注后，周細胞在BBB結構和功能改變中起到一定的作用，而缺血后處理能夠減少缺血再灌注對周細胞的損傷，從而起到保護BBB的作用，但是周細胞在缺血再灌注后對BBB的作用機制以及缺血后處理對周細胞的保護機制，還有待進一步研究。周細胞為腦缺血后神經保護提供了新的靶點，同時為臨床治療腦梗死提供新的思路。

4參考文獻

1Bell RD，Winkler EA，Sagare AP，etal.Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging〔J〕.Neuron，2010;68(3):409-27.

2Thanabalasundaram G，Pieper C，Lischper M，etal.Regulation of the blood-brain barrier integrity by pericytes via matrix metalloproteinases mediated activation of vascular endothelial growth factor in vitro〔J〕.Brain Res，2010；1347(1)：1-10.

3Zacharek A，Chen J，Cui X，etal.Angiopoietin1/Tie2 and VEGF/Flk1 induced by MSC treatment amplifies angiogenesis and vascular stabilization after stroke〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2007；27(10)：1684-91.

4Fisher M.Pericyte signaling in the neurovascular unit〔J〕.Stroke，2009；40(suppl 3)：S13-5.

5韓冬，張碩，翟志永，等.缺血后處理的腦保護作用的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(23)：4728-30.

6Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK.Interrupting reperfusion as a stroke therapy：ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2006；26(9)：1114-21.

7Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

8Lo EH，Dalkara T，Moskowitz MA.Mechanisms，challenges and opportunities in stroke〔J〕.Nat Rev Neurosci，2003；4(5)：399-415.

9Joo SP，Xie W，Xiong X，etal.Ischemic postconditioning protects against focal cerebral ischemia by inhibiting brain inflammation while attenuating peripheral lymphopenia in mice〔J〕.Neuroscience，2013；243：149-57.

10Robin E，Simerabet M，Hassoun SM，etal.Postconditioning in focal cerebral ischemia：role of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel〔J〕.Brain Res，2011；1375：137-46.

11Xing B，Chen H，Zhang M，etal.Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat〔J〕.Stroke，2008；39(8)：2362-9.

12Han D，Zhang S，Fan B，etal.Ischemic postconditioning protects the neurovascular unit after focal cerebral ischemia/reperfusion injury〔J〕.J Mol Neurosci，2014；53(1)：50-8.

13Peppiatt CM，Howarth C，Mobbs P，etal.Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes〔J〕.Nature，2006；443(7112)：700-4.

14Kamouchi M，Kitazono T，Ago T，etal.Hydrogen peroxide-induced Ca2+responses in CNS pericytes〔J〕.Neurosci Lett,2007；416(1)：12-6.

15Nakamura K，Kamouchi M，Kitazono T，etal.Amiloride inhibits hydrogen peroxide-induced Ca2+responses in humuan CNS pericytes〔J〕.Microvasc Res,2009；77(3)：327-34.

16Yemisci M，Gursoy-Ozdermir Y，Vural A，etal.Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery〔J〕.Nat Neurosci,2009；15(9)：1031-7.

17Dalkara T，Gurosoy-Ozdermir，Yemisci M.Brain microvascular pericytes in health an disease〔J〕.Acta Neuropathol,2011；122(1)：1-9.

18Hayashi K，Nakao S，Nakaoke R，etal.Effects of hypoxia on endothelial/pericytic co-culture model of the blood-brain barrier〔J〕.Regul Pept，2004；123(1-3)：77-83.

19Duz B，Oztas E，Erginay T，etal.The effect of moderate hypothermia in acute ischemic stroke on pericyte migration：an ultrastructural study〔J〕.Cryobiology，2007；55(3)：279-84.

20Ren C，Gao X，Niu G，etal.Delayed postconditioning protects against focal ischemic brain injury in rats〔J〕.PLoS One，2008；3(12)：e3851.

21Takata F，Dohgu S，Matsumoto J，etal.Brain pericytes among cells constituting the blood-brain barrier are highly sensitive to tumor necrosis factor-alpha，releasing matrix metalloproteinase-9 and migrating in vitro〔J〕.J Neuroinflammation，2011；8(1)：106.

22Nagel S，Su Y，Horstmann S，etal.Minocycline and hypothermia for reperfusion injury after focal cerebral ischemia in the rat：effects on BBB breakdown and MMP expression in the acute and subacute phase〔J〕.Brain Res，2008；1188：198-206.

23Liu XR，Luo M，Yan F，etal.Ischemic postconditioning diminishes matrix metalloproteinase 9 expression and attenuates loss of the extracellular matrix proteins in rats following middle cerebral artery occlusion and reperfusion〔J〕.CNS Neurosci Ther，2012；18(10)：855-63.

〔2014-01-05修回〕

(編輯曹夢園)