膜型基質金屬蛋白酶1在膠質瘤及瘤旁組織中的表達及臨床意義

膜型基質金屬蛋白酶1在膠質瘤及瘤旁組織中的表達及臨床意義

付勝偉岳樹源

(天津醫科大學總醫院神經外科，天津300480)

摘要〔〕目的探討膜型基質金屬蛋白酶1(MT1-MMP)在膠質瘤及瘤旁組織中的表達及臨床意義。方法選擇54例膠質瘤標本及瘤旁相對正常腦組織，應用Western印跡實驗及RT-PCR檢測MT1-MMP的表達情況，并與臨床相關特征進行關聯分析。結果Western印跡結果顯示MT1-MMP在不同級別膠質瘤中表達具有差異性，膠質瘤級別越高其條帶灰度值越高，膠質瘤級別越低表達越弱。RT-PCR結果顯示MT1-MMP mRNA的表達呈現出與Western印跡結果一致的趨勢，正常腦組織、Ⅰ、Ⅱ級膠質瘤與Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤之間表達具有統計學差異(P<0.05)，而Ⅲ級與Ⅳ級膠質瘤之間無明顯差異性，并且MT1-MMP表達與患者生存期呈明顯的負相關性。結論MT1-MMP的表達與膠質瘤級別相關，有可能是一個潛在的膠質瘤基因靶向治療的位點。

關鍵詞〔〕膜型基質金屬蛋白酶1；膠質瘤；癌旁組織

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：岳樹源(1962-)，男，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事腦腫瘤、腦血管病的手術治療研究。

第一作者：付勝偉(1978-)，男，主治醫師，在讀碩士，主要從事腦外傷、腦出血的診斷和治療研究。

膠質瘤是最常見的顱內原發腫瘤，預后差，致殘率及致死率均很高〔1〕。膠質瘤發病原因尚不明確，目前認為可能與先天遺傳易感性、后天環境因素以及電離輻射相關。基質金屬蛋白酶(MMPs)被認為與多種惡性腫瘤的發生和浸潤有關〔2〕， 膜型基質金屬蛋白酶1(MT1-MMP)是MMPs家族中最重要的成員之一，被認為與腫瘤的增殖、凋亡、浸潤、轉移以及血管形成等密切相關〔3〕。本研究對原發膠質瘤以及瘤旁相對正常腦組織MT1-MMP水平進行檢測，分析其與臨床相關特征的關聯。

1資料與方法

1.1一般資料收集天津醫科大學總醫院2009年1月至2010年12月行膠質瘤手術切除的病例54例，對其病歷資料進行整理，并且在手術室收集部分膠質瘤標本及瘤旁2 cm外相對正常腦組織標本。術后經病理證實為原發性膠質瘤，其中Ⅰ級4例，Ⅱ級10例，Ⅲ級17例，Ⅳ級23例；男31例，女23例，年齡56～71〔平均(68.9±12.4)〕歲。手術標本均為新鮮標本，在手術過程中由術者在顯微鏡下確認為膠質瘤或腦組織標本后取下，迅速置于液氮中保存。納入及排除標準：①患者為首次行膠質瘤切除術；②術后均堅持完成放療、化療等系統性治療，放療為全腦照射+術區照射相結合，化療藥物為泰道(替莫唑胺)；③無身體其他部位腫瘤，無其他嚴重慢性疾病；④無血液系統的疾病及其他免疫性疾病。

1.2Western印跡蛋白提取：將凍存于液氮的組織標本取出后，迅速研磨成粉末，并加入蛋白酶抑制劑及蛋白裂解液，冰上放置5 min后，12 000 r/min離心15 min，棄去下層沉淀，上清中加入5倍緩沖液煮沸5 min，行蛋白定量。一抗：單克隆抗膜型基質金屬蛋白酶抗體(美國ebioscience公司)，二抗：山羊抗小鼠(中杉金橋生物科技公司)。配制10%的下層膠，5%上層膠，注入樣品后，以80 V恒定電壓進行樣品壓縮，待樣品進入分離膠后，加電壓120 V，至跑出所需要的條帶止，進行轉膜，350 mA恒定電流，約120 min。BSA封閉2 h，加入一抗過夜，次日加入二抗，洗脫，顯色。

1.3RT-PCRRNA提取：膠質瘤及癌旁正常腦組織50～100 mg研成粉末，應用Trizol 抽打勻漿，加入0.2 ml氯仿劇烈震蕩后，靜置離心15 min取上層水相，進一步加入異丙醇沉淀水相中的RNA，DEPC處理水溶解RNA保存在液氮或低溫冰箱。分光光度計檢測260/280吸光度比值，計算RNA濃度。

逆轉錄：在20 μl體系中，加入1 μg總RNA,1 μl oligo dT12～18(500 μg/ml)。RNase-Free水，70℃溫育10 min后立即冰浴冷卻，繼續加入4 μl 5倍緩沖液,2 μl 0.1 mol/L DTT,1 μl 10 mol/L dNTPs (10 mol/L/種)，混勻后于42℃保溫2 min，加入1 μl(200 U)的反轉錄酶，42℃繼續溫育50 min。70℃15 min滅活反轉錄酶。mRNA反轉錄成cDNA后-20℃儲存。PCR：建立PCR反應體系，由上海康城生物技術公司提供PCR引物合成，引物序列：3′-5′:CATCCATGAGAACTATGGTATC,5′-3′:CCCCAAAAAGTTCCTGGATG。反應條件為94℃ 2 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min 為第一步1個循環； 94℃ 45 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min 為第二步30個循環；72℃ 10 min延伸。應用RT-PCR儀自帶分析軟件，產生PCR擴增曲線。

2結果

2.1Western印跡結果MT1-MMP在不同級別膠質瘤中表達具有一定的差異性，膠質瘤級別越高其條帶灰度值越高，膠質瘤級別越低表達越弱，而在相對正常腦組織中表達最低(圖1)。

圖1　各組MT1-MMP表達的Western印跡結果

2.2RT-PCRMT1-MMP mRNA的表達呈現出與Western印跡結果一致的趨勢，腦組織(0.681±0.203)、Ⅰ級(1.158±0.539)、Ⅱ級(1.130±0.555)膠質瘤與Ⅲ級(1.710±0.793)、Ⅳ級(1.849±0.690)膠質瘤之間mT1-MMP表達具有統計學差異(P<0.05)，而Ⅲ級與Ⅳ級膠質瘤之間無明顯差異性。

2.3MT1-MMP表達水平與膠質瘤臨床特征的關系對所有患者進行跟蹤隨訪直至死亡，未死亡的病例隨訪至2年。對患者性別、年齡、腫瘤復發情況、生存期等臨床特點與MT1-MMP表達情況進行相關性分析，結果性別、年齡等與患者MT1-MMP表達情況無相關性，而腫瘤級別與MM1-MMP表達呈正相關，生存期與MT1-MMP表達呈負相關性。見表1。

表1MT1-MMP表達情況與臨床特征的相關性〔n(%)〕

指標nMT1-MMP高表達P值性別 男3121(66.6)0.9021 女2317(68.2)年齡(歲) ≤603625(70.27)0.7015 >601813(66.66)腫瘤級別 Ⅰ40(0)0.0201 Ⅱ103(30.00) Ⅲ178(47.05) Ⅳ2317(73.91)生存期(個月) ≤62815(61.80)0.0391 >62623(90.47)

3討論

膠質瘤多呈浸潤性生長、邊界不清，往往伴有壞死、出血等病理形態，是致死率最高的惡性腫瘤之一。目前臨床上針對膠質瘤的治療主要是“手術+放療+化療”的系統治療方案，但由于膠質瘤邊界不清，多生長在重要的腦功能區，所以手術常很難完全切除，而其對放療敏感性較差，同時由于血腦屏障的限制，化療藥物作用有限，因此膠質瘤預后較差，特別是膠質母細胞瘤，多數患者生存期僅數月到1年。膠質瘤的基因靶向治療是近年來興起的治療方式，楊學軍等〔4〕對膠質瘤基因治療做了大量的研究，在體外實驗中取得了一定的成果。

MT1-MMP是膜型MMPs家族中的成員之一，主要參與細胞外基質的降解和激活MMPs家族另外的多種金屬基質蛋白酶，對腫瘤的侵襲、擴散、細胞增殖及腫瘤新生血管的形成都具有直接的誘導和促進作用。MT1-MMP可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原，破壞腫瘤擴散轉移的重要生理屏障。文獻〔5〕報道MT1-MMP可以通過與不同的細胞因子相互作用而加快腫瘤細胞的遷移，而Udayakumar等〔6〕報道MT1-MMP可以通過上調血管內皮細胞生長因子，誘導堿性成纖維細胞生長因子、轉化生長因子、肝細胞生長因子等表達，從而促進腫瘤血管的生成。而事實上MT1-MMP的表達同樣受到多種因素的調節，Lee等〔7〕報道金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)是MT1-MMP的天然內源性抑制因子，通過調低TIMP后腫瘤細胞系的生長受到明顯抑制。

徐濤等〔8〕檢測123例肝癌組織，依據腫瘤進展程度將其分為浸潤組和非浸潤組，結果顯示MT1-MMP在浸潤組的表達明顯高于對照組，并且浸潤組中伴有血清VEGF 的升高和腫瘤血管的增加。苗杰〔9〕則探討了胃癌組織中CD147、MT1-MMP表達情況，結果顯示胃癌組織中MT1-MMP、CD147表達明顯高于正常胃黏膜組織，且與分化程度、轉移程度、淋巴結轉移等密切相關；CD147蛋白表達與MT1-MMP呈正相關(r=0.467，P<0.01)。MT1-MMP在膠質瘤中的表達也有相關報道〔10〕，其結果與本文基本相似，但未作出臨床特征關聯。姚廣裕等〔11〕發現MT1-MMP可以通過激活MMP-2影響乳腺癌細胞株的浸潤能力。

總之，筆者認為MT1-MMP對膠質瘤的發生、發展具有一定的影響和促進作用，但是膠質瘤的各種生物學行為受到多種基因的調控，MT1-MMP在膠質瘤生長中的具體作用目前尚不得而知，需要通過深入的基礎研究進行探討。但在本研究中MT1-MMP在高級別膠質瘤中表達明顯增強，并且與生存期呈負相關，至少提示有可能將MT1-MMP作為一個潛在靶向基因治療的位點，為膠質瘤的治療提供一個新的方向。

4參考文獻

1Satoru Kawarazaki, Kazuya Taniguchi, Mitsuaki Shirahata，etal.Conversion of a molecular classifier obtained by gene expression profiling into a classifier basedon real-time PCR: a prognosis predictor for gliomas〔J〕.BMC Med Genom,2010;3(52):1755-67. Kawarazaki, Kazuya Taniguchi, Mitsuaki Shirahata，etal.Conversion of a molecular classifier obtained by gene expression profiling into a classifier basedon real-time PCR: a prognosis predictor for gliomas〔J〕.BMC Med Genom,2010;3(52):1755-67.

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10Williams BB, Mundell N, Dunlap J,etal.The planar cell polarity protein VANGL2 coordinates remodeling of the extracellular matrix〔J〕.Commun Integr Biol,2012;5(4):325-8.

11姚廣裕，曾木圣，林鵬，等.膜型基質金屬蛋白酶1對乳腺癌細胞浸潤能力的影響〔J〕.中華腫瘤雜志，2006;28(9)：650-3.

〔2013-07-11修回〕

(編輯徐杰)