應用熒光原位雜交檢測初治慢性淋巴細胞白血病患者的分子遺傳學異常

應用熒光原位雜交檢測初治慢性淋巴細胞白血病患者的分子遺傳學異常

劉志何劉春水李薇白晶白鷗

(吉林大學第一醫院腫瘤中心，吉林長春130021)

摘要〔〕目的探討熒光原位雜交(FISH)技術檢測慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者分子遺傳學異常的臨床意義。方法應用FISH技術，采用4種特異性DNA探針檢測88例初治CLL患者的分子遺傳學異常，并結合患者臨床資料，分析各分子遺傳學異常與臨床分期的關系。結果88例CLL患者中，52例出現分子遺傳學異常，總異常率為59.1%。RB1基因異常發生率最高，為30.7%，其后依次為CSP12(27.3%)、P53及ATM缺失發生率均約為8.0%。結論FISH技術檢測分子遺傳學異常的敏感性和特異性較高。RB1基因異常是CLL最常見的分子遺傳學異常。伴P53及ATM基因異常的的CLL分期較晚，預后較差。

關鍵詞〔〕慢性淋巴細胞白血病；分子遺傳學；熒光原位雜交

中圖分類號〔〕R446.8〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：白鷗(1965-)，女，教授，主要從事淋巴瘤的臨床診斷與治療研究。

第一作者：劉志何(1987-)，男，碩士，主要從事白血病的臨床診斷與治療研究。

慢性淋巴細胞白血病(CLL)以中老年人群為主。CLL患者生存期個體差異很大。1976年Rai等〔1〕提出的Rai分期系統以及1981年Binet等〔2〕提出的Binet分期系統是目前CLL的經典分期系統，但這些分期系統在預測分期早或預后不良患者疾病生物學行為及預后方面仍存在不足〔3〕。文獻〔4〕報道，細胞遺傳學異常與CLL患者生物學行為及預后密切相關。但CLL分裂期細胞比例低，傳統細胞遺傳學檢測(CC)僅能檢測出約20%的細胞遺傳學異常，而熒光原位雜交(FISH)技術不僅可檢測分裂期細胞，亦可檢測間期細胞的分子遺傳學異常，故在CLL患者中可檢測出80%以上的分子遺傳學異常，大大提高了陽性率〔5〕。本研究應用FISH技術，采用4種特異性DNA探針檢測88例初治CLL患者的分子遺傳學異常，并結合患者的臨床資料來探討各種分子遺傳學異常與疾病分期及預后的關系。

1資料與方法

1.1資料2009年7月至2014年7月在我院診斷的門診和住院CLL患者88例，男49例，女39例，年齡40～84歲，中位年齡61.5歲。所有病例診斷標準參照《血液病診斷及療效標準》〔6〕。根據Rain分期，0期10例，Ⅰ期30例，Ⅱ期18例，Ⅲ期15例，Ⅳ期15例。選取我科28例健康骨髓捐獻者的骨髓標本為對照組。

1.2方法

1.2.1骨髓標本的預處理兩組標本均取其新鮮骨髓血2 ml，經1 400 r/min離心7 min后去掉上清液，然后加盛有預熱至37℃的0.075 mol/L KCl至8 ml，混勻后37℃溫浴30 min，取出后加1 ml固定液(甲醇：冰乙酸為3∶1)，混勻后1 400 r/min離心7 min，去上清；再加固定液至8 ml，混勻后室溫下靜置30 min，離心，去上清，如此再重復2次，再加固定液2 ml混勻后用EP管保存備用。用吸管取EP管里的標本滴于干凈的玻片上，自然干燥后將玻片置于56℃的烤片機上30 min，取出玻片后放入2×SSC、2×SSC溶液中各5 min，取出后將玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇各2 min脫水。自然干燥玻片。

1.2.2FISH操作步驟①探針：采用4種特異性DNA探針，分別為RB1、ATM、P53、CSP12，分別定為于13q14、11q22.3、17p13.1、12p11.1-12q11.1，以上探針均購于北京金蓓嘉生物技術公司。②標本的準備及變性：用砂輪在玻片背面固定標本的對應區域標記出雜交區域，保證變性溫度達到78℃，雜交溫度達到37℃。③探針混合物準備及變性雜交：室溫下將7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水、2 μl探針加至離心管，離心3～5 s，置于雜交儀中變性5 min(78℃)，雜交16 h(37℃)。④玻片洗滌：將雜交后的玻片取出去掉蓋玻片，放入46℃預溫的2×SSC溶液中，輕輕晃動，洗滌5 min，后放入46℃預溫的0.1×NP40溶液中，輕輕晃動，洗滌3 min，轉至室溫，置于70%的乙醇中洗滌2 min，室溫干燥。⑤復染：加10 μl 4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染劑，加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3熒光顯微鏡檢測及結果判讀在熒光顯微鏡選擇符合標準的區域觀察。在正常間期細胞中RB1為2個綠色(2G)，ATM為2個紅色(2R)，P53為2個綠色(2G)，CSP12為2個紅色(2R)；在異常間期細胞中RB1為1G，ATM為1R，P53為1G，CSP12為3R。

2結果

2.1對照組28例對照組標本中每一種探針均觀察300個間期細胞，統計出異常情況的細胞比例并建立閾值(閾值=均值+3×標準差)。RB1閾值為4.6%，ATM閾值為5.0%，P53閾值為4.8%，CSP12閾值為3.8%。

2.2病例組

2.2.1FISH檢測結果88例初治CLL患者中，無分子遺傳學異常36例(40.9%)，59.1%(52/88)的患者至少存在1種以上的分子遺傳學異常，52例分子遺傳學異常的患者中，單一分子遺傳學異常的40例(45.51%)，合并2種分子遺傳學異常的11例(12.5%)，合并3種分子遺傳學異常的1例(1.1%)。

最常見的分子遺傳學異常類型為RB1缺失，發生率為30.7%(27/88)，其次為12號染色體的增加，發生率為27.3%(24/88)，發生率最低的為P53和ATM，均為8.0%(8/88)。

2.2.2分子遺傳學異常與Rain分期的關系僅RB1分子遺傳學異常的患者19例，其中57.9%(11/19)的患者Rain分期為0或Ⅰ期，42.1%(8/19)的患者分期為Ⅱ～Ⅳ期。單獨12號染色體異常的CLL患者19例，其中52.6%(10/19)的患者分期為I期，47.4%(9/19)的分期為Ⅱ～Ⅳ期。14例患者P53或ATM單獨缺失或者合并RB1缺失，85.7%的患者分期為Ⅲ～Ⅳ期。見表1。

表1根據Rain分期的分子遺傳學異常〔n(%)〕

Rain分期nATMRB1P53CSP120101(14.3)4(14.8)0(0.0)0(0.0)Ⅰ300(0.0)7(25.9)0(0.0)11(45.8)Ⅱ181(14.3)5(18.5)0(0.0)4(16.7)Ⅲ154(57.2)6(22.2)3(42.9)3(12.5)Ⅳ151(14.3)5(18.5)4(57.1)6(25.0)

3討論

CLL是一種低度惡性的克隆性淋巴細胞疾病，其生物學行為存在異質性。目前認為分子遺傳學異常與CLL生物學行為及預后密切相關，分子遺傳學異常主要涉及RB1、ATM、P53、CSP12。相關資料報道，僅涉及RB1基因異常的CLL患者中位生存時間為133個月，僅涉及12號染色體基因異常的CLL患者生存期為114個月，僅涉及ATM基因異常的CLL患者生存期為79個月，僅涉及P53基因異常的CLL患者生存期為32個月。

Durak等〔4〕對79例初治CLL患者進行FISH檢測，其中13q14.3缺失發生率最高，為32.9%，其后依次為P53缺失(7.6%)、ATM缺失(5.1%)、CSP12(15.2%)；El-Taweel等〔6〕應用FISH缺失對46例初治CLL患者進行了檢測，13q14缺失發生率最高，為70%，其后依次為P53(24%)、ATM(21.7%)、CSP12(17%)；曹鵬飛等〔7〕應用FISH檢測46例初治CLL患者，分子遺傳學異常發生率依次為ATM缺失(17.4%)、13q14.3缺失(30.4%)、P53缺失(15.2%)、CSP12缺失(21.7)、RB1缺失(10.9%)；戴丹等〔8〕應用FISH對30例初治CLL患者進行了檢測，其中發生率最高的為RB1缺失(43.3%)，其后依次為CSP12缺失(23.3%)、ATM缺失(13.3%)、P53缺失(10.0%)。本研究與戴丹報道基本一致，而不同于其他文獻報道數據。考慮可能與各研究中心所制定的閾值不同有關。目前國外將FISH檢測的閾值定為20%，而國內目前對于CLL的FISH檢測尚未制定可參照的標準閾值。

RB1基因為CLL患者最常見的分子遺傳學異常，且在伴IgHV基因突變的CLL患者中更易見，相關文獻報道〔9〕，伴RB1基因缺失的CLL患者預后較好。

12號染色體三體可見于15%～23%的CLL患者〔10〕，既往文獻報道〔11〕，伴CSP12的CLL患者與高增殖、分期晚及生存期短有關。但在生存期上優于伴有P53或者ATM基因異常的CLL患者，本研究提示預后一般。

ATM基因位于11q22，該區域基因異常導致ATM基因成為雜合子〔12〕。ATM基因可傳導DNA損傷信號及介導P53基因活化，在維持基因穩定性方面具有重要作用。P53基因為抑癌基因，其功能正常具有重要的臨床意義，P53基因缺失后導致P53蛋白失去正常功能，而P53蛋白無功能是疾病進展和治療耐藥的關鍵環節。

4參考文獻

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〔2013-12-09修回〕

(編輯袁左鳴)