線粒體乙醛脫氫酶2對β淀粉樣蛋白所致神經元損傷的作用及機制

線粒體乙醛脫氫酶2對β淀粉樣蛋白所致神經元損傷的作用及機制

楊英龔忠厚1李翠張倩王智斌韓亞軍陳陽葛偉

(第四軍醫大學西京醫院老年病科，陜西西安710032)

摘要〔〕目的探討線粒體乙醛脫氫酶(ALDH)2對β淀粉樣蛋白(Aβ)所致神經元損傷的作用及機制。方法應用HT-22小鼠海馬神經元細胞系，MTT法檢測明確Aβ25～35負載濃度制成Aβ神經元損傷模型；ALDH2激活劑Alda-1、ALDH2抑制劑Daidzin 干預后，Western印跡檢測ALDH2蛋白表達水平；并采用ELISA檢測4-HNE含量、以熒光素酶法檢測細胞內的ATP含量。結果HT22細胞負載Aβ25～35(濃度50 μmol/L)時細胞生存率有顯著降低；ALDH2激活劑Alda-1、ALDH2抑制劑Daidzin干預后，ALDH2蛋白表達水平并未發生變化，也并未導致細胞生存率改變；加入Alad-1后負載Aβ25～35的HT22細胞4-HNE含量顯著減少，細胞內ATP含量明顯提高，與Aβ組相比較有顯著差異(P<0.05)。結論ALDH2激活后能有效減輕Aβ導致的神經元損傷，可能通過減少細胞內4-HNE含量、增加ATP含量實現其細胞保護的作用。

關鍵詞〔〕阿爾茨海默??；線粒體乙醛脫氫酶2；β淀粉樣蛋白

中圖分類號〔〕R592〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81271449，81471409)

通訊作者：葛偉(1972-)，女，副主任醫師，副教授，醫學博士，碩士生導師，主要從事老年病學醫療、教學、科研工作。

1蘭州軍區臨潼療養院第二療養區

第一作者：楊英(1984-)，男，在讀碩士，醫師，主要從事阿爾茨海默病機制及治療研究。

Effects and mechanism of mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 on neuronal damage caused by amyloid

YANG Ying, GONG Zhong-Hou, LI Cui,etal.

Department of Geriatrics, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, Shaanxi, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the role of mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) on neuronal damage induced by β-amyloid(Aβ).MethodsHT-22 mouse hippocampal neuronal cell line was used, MTT was used to determine Aβ concentration. Western bolt was used to detect ALDH2 protein level, ELISA was used to detect 4-HNE content, luciferase enzyme was used to detect intracellular ATP content.ResultsThe cell survival rate was significantly decreased when HT22 cells loaded with 50 μmol/L Aβ25～35. The expression level of ALDH2 protein and the cell survival rate of HT22 did not change when intervened by ALDH2 activator Alda-1 and the inhibitor Daidzin, further experimental results showed that Alad-1 could improve the increased 4-HNE content and the reduced ATP in HT22 when cells loaded Aβ25～35.ConclusionsALDH2 activation might elicit neuronal protective effect against Aβ25～35 through reducing 4-HNE levels and increasing ATP content of the intracellular.

【Key words】Alzheimer′s disease; Mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2;β-amyloid

乙醛脫氫酶(ALDH2)因其能夠直接、間接介導機體各組織器官、細胞代謝過程中產生的細胞毒性反應性醛類等物質，在細胞保護方面起著舉足輕重的關鍵性作用〔1〕。ALDH2基因缺失增加患阿爾茨海默病(AD)的危險性，ALDH2敲除小鼠更易遭受氧化應激損傷、出現增齡相關性神經退行性病理改變和記憶力喪失〔2〕。然而ALDH2能否在細胞水平、在β淀粉樣蛋白(Aβ)負載后所致AD細胞模型上實現其神經細胞保護效應及其機制目前尚不明確。本實驗觀察ALDH2對Aβ所致海馬神經元HT22細胞系損傷的影響。

1材料和方法

1.1材料Aβ25～35購于Sigma(SCP0014)公司。ALDH2抑制劑Daidzin購自Enzo(CAS552-66-9)，ALDH2激活劑Alda-1購自Gemany Merck(CSA349438-38-6)。HT22細胞由第四軍醫大學西京醫院神經外科惠贈。

1.2細胞培養小鼠海馬神經元HT22細胞，以10%胎牛血清( Gibco 16000-044)和90%高糖DMEM( Gibco 11995-065)培養，細胞培養條件37℃孵箱5%CO2與95%空氣。密度60%～80%時加入藥物進行干預。Aβ25～35溶解于無菌水中，37℃老化7 d。設計濃度梯度0、20、50、100 μmol/L 。ALDH2抑制劑Daidzin溶解于DMSO，ALDH2激活劑Alda-1溶解于DMSO，與Aβ共同加入細胞培養體系中。

1.3MTT實驗含10%胎牛血清的培養液配成單個細胞懸液，以每孔1 000～10 000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。同一般培養條件，培養3～5 d每孔加MTT溶液20 μl。繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡率取對數生長期細胞，以1×106傳代至六孔板中，第一組：空白對照組；第二組：Aβ50 μmol/L；第三組：Alda-1 50 μmol/L；第四組：Daidzin 60 μmol/L；第五組：Aβ 50 μmol/L+Alda-1 50 μmol/L；第六組 Aβ 50 μmol/L+Daidzin 60 μmol/L處理24 h后，送第四軍醫大學免疫教研室流式細胞中心，進行流式凋亡率檢測。

1.5ELISA檢測4-HNE含量取對數生長期細胞，以2×105傳代至24孔板，分為六組分組同上所述，每組設三個復孔處理24 h，用PBS(pH7.2～7.4)稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成分，制成樣品進行ELISA檢測。用純化的小鼠4-HNE抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入4-HNE再與HRP標記的4-HNE抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的4-HNE呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中小鼠4-HNE濃度。

1.6Western印跡取對數生長期細胞，傳代至六孔板密度1×106，Alda-1組濃度設定分別0、10、20、50、100 μmol/L；Daidzin濃度設定分別為0、10、30、60、120 μmol/L藥物處理24 h后提取蛋白，配10%SDS-PCAG凝膠。一抗anti ALDH1/2 1∶1 000(Santa)過夜，二抗：山羊Anti-兔IgG H&L (HRP) (ab6721)。使用ImageJ軟件掃描灰度與GAPDH對比得出蛋白相對灰度值。

1.7熒光素酶法檢測ATP含量取對數生長期細胞，以1×106傳代至六孔板中，第一組：陰性對照組；第二組：Aβ 50 μmol/L；第三組：Alda-1 50 μmol/L；第四組：Daidzin 60 μmol/L；第五組：Aβ 50 μmol/L+Alda-1 50 μmol/L；第六組Aβ 50 μmol/L+Daidzin 60 μmol/L，處理24 h后，使用ATP檢測試劑盒(Beyotime S0026)按照步驟操作。

1.8統計學方法采用SPSS19.0統計學分析軟件對數據的組間比較進行t檢驗。

2結果

2.1Aβ25～35對HT22的細胞損傷作用與空白對照組相比(3.51±0.25)，負載Aβ25～35濃度為20 μmol/L處理后細胞生存率無顯著變化(3.03±0.33,P>0.05)，Aβ25～35濃度50 μmol/L處理后，細胞生存率有顯著性降低(2.11±0.71,P<0.05)，且隨著Aβ25～35濃度增加至100 μmol/L細胞生存率(1.44±0.20)與50 μmol/L組無顯著性差別(P>0.05)。

2.2ALDH2對Aβ所致HT22細胞生存率的影響與陰性對照組(3.57±0.41)相比，Aβ組OD值明顯減低(2.17±0.93,P<0.05)；但單純應用Alda-1(3.44±0.33)、Daidzin(3.37±0.28)后，與陰性對照組相比細胞生存率無顯著性變化。與Aβ組相比，Aβ+Alda-1組細胞生存率明顯提高(3.31±0.47,P=0.02)；加入ALDH2抑制劑Aβ+Daidzin組較單純使用Aβ組細胞生存率無差異(1.36±0.35，P>0.05)。

2.3Alda-1、Daidzin對ALDH2蛋白表達含量及對HT22細胞生存率的影響不同濃度Alda-1或Daidzin處理HT22細胞24 h后，細胞內ALDH2蛋白的含量無明顯變化；且對HT22細胞生存率亦沒有明顯影響(P>0.05)，見表1，圖1。

組別(μmol/L)吸光度(OD)組別(μmol/L)吸光度(OD)陰性對照組3.99±0.40陰性對照組3.27±0.16Alda-1103.53±0.91Daidzin103.44±0.53Alda-1203.51±0.11Daidzin303.31±0.33Alda-1503.62±0.08Daidzin603.68±0.08Alda-11003.41±0.77Daidzin1202.52±0.42

圖1　Alda-1、Daidzin對ALDH2蛋白表達含量的影響

2.4ALDH2激活劑及抑制劑對神經元保護作用機制與陰性對照組相比，Aβ組4-HNE含量明顯增加(P<0.05)；但單純應用Alda-1、Daidzin后，對4-HNE含量無顯著影響；與Aβ處理組相比，加入ALDH2激活劑Alad-1后4-HNE含量明顯降低(P<0.05)；使用ALDH2抑制劑Daidzin后4-HNE含量與Aβ組相比無明顯變化(P>0.05)。另外，熒光素酶法ATP含量檢測發現，與陰性對照組相比，Aβ組ATP含量顯著降低(P<0.05)，ALDH2激活后能顯著改善細胞內ATP含量，與Aβ組相比有統計學差異(P<0.05)。見表2。

組別(μmol/L)4-HNE含量(ng/L)ATP含量(μmol/L)陰性對照組1.7±0.210.25±0.030Aβ504.1±0.631)0.11±0.0231)Alda-1501.6±0.110.22±0.025Daidzin601.8±0.160.23±0.024Aβ50+Alda-1502.4±0.212)0.21±0.0312)Aβ50+Daidzin604.4±0.351)0.10±0.081)

與陰性對照組比較：1)P<0.05；與Aβ50組比較：2)P<0.05

3討論

本文結果提示ALDH2激活劑Alda-1能有效保護HT22細胞免受Aβ25～35損傷，并可能通過減少細胞內4-HNE含量、增加ATP含量實現其細胞保護的作用。

以乙酰膽堿酯酶抑制劑和(或)NMDA受體拮抗劑為主的藥物治療及對癥治療作為目前臨床治療AD的最主要方法，其療效十分有限〔3〕。ALDH2是一個核編碼線粒體酶，定位于線粒體基質〔1〕，在細胞保護方面發揮著關鍵性作用，能顯著減少酒精相關性疾病的發病率，減少缺血再灌注導致的細胞損傷〔4〕。ALDH2在中樞神經系統中廣泛表達，但其在中樞神經系統中的功能以及中樞神經系統相關疾病中的作用目前仍不明確。國內外流行病學調查研究結果顯示，ALDH2缺失型患者AD患病率明顯增高〔5〕；動物實驗結果顯示，ALDH2基因敲除小鼠更易遭受氧化應激損傷，表現出增齡相關性神經退行性病理改變及記憶力喪失等一系列神經功能障礙；細胞水平實驗顯示，在原代培養海馬神經元中過表達ALDH2可有效抑制有毒醛類導致神經元凋亡、氧化應激及線粒體損傷〔6〕。ALDH2過表達有顯著的腦卒中后神經元保護作用〔7〕。在小鼠的腦卒中缺血再灌注模型中過表達ALDH2能有效減輕氧自由基對神經元造成的損傷，使缺血區再灌注區域的神經元死亡數目減少〔8〕。但是，缺血再灌注和大量的有毒醛類處理和病理狀態下的AD神經元損傷模式還是不同，以往實驗均未涉及AD的核心機制——Aβ引起的神經元損傷，也沒有回答ALDH2能否改善AD認知功能障礙、實現神經細胞保護。

Aβ通過氧化應激、細胞凋亡及促發炎癥級聯反應等途徑引起或促進AD發展〔9〕。腦內神經元胞內Aβ沉積是AD致病的核心機制之一，也是治療AD的潛在靶點之一〔10〕。4-HNE是細胞氧化應激條件下脂質過氧化產生，能與線粒體DNA結合導致線粒體損傷及功能障礙的毒性醛類〔6〕。有報道ALDH2能發揮其還原酶的作用，脫氫形成對細胞無傷害的乙酸，恢復神經元線粒體功能〔11〕。ATP是細胞最直接能量來源，是衡量線粒體功能的核心指標，AD病理條件下神經元線粒體ATP產生大量減少，導致神經元凋亡，是AD的重要發病機制。

本研究使用ALDH2的特異性激活劑Alda-1〔12〕，結果證實ALDH2激活能在細胞水平減少AD核心致病機制Aβ所致的神經元損傷，從而減少神經元的凋亡，并且這一作用可能與ALDH2含量關系不大，而與ALDH2還原酶活性有關。進一步研究顯示Alda-1可以減少4-HNE的產生，使線粒體功能得到修復，并使ATP產生明顯增加，進一步提示ALDH2激活后產生的細胞保護作用可能與線粒體凋亡信號通路有關。

流行病學調查顯示ALDH2基因突變者更容易罹患AD〔13〕。我國人群的流行病學調查中，有40%中國人群中編碼ALDH2蛋白的基因存在缺陷，酶蛋白487位的谷氨酸(Glu)被賴氨酸(Lys)取代，得到沒有活性的ALDH2蛋白〔14〕。本文提示，ALDH2活性可能與AD發生、發展密切相關，而我國老年人群中大量的AD患者是否與ALDH2蛋白失活相關還需深入研究。

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〔2013-12-17修回〕

(編輯曹夢園)