重組人乳鐵蛋白對口腔癌Tca8113細胞周期及周期調控因子cyclinD1、p19和p27基因表達的影響

重組人乳鐵蛋白對口腔癌Tca8113細胞周期及周期調控因子cyclinD1、p19 和 p27 基因表達的影響

萬英明

(吉林醫藥學院附屬醫院口腔科，吉林吉林132021)

摘要〔〕目的探討重組人乳鐵蛋白(rhLF)對口腔癌Tca8113細胞周期以及其調控因子cyclinD1、p19和p27基因表達的影響。方法使用0、50和100 μg/ml rhLF處理體外培養Tca8113細胞24、48、72 h，采用流式細胞儀、MTT法和RT-PCR法分析細胞周期、活細胞情況及cyclinD1、p19和p27基因表達。結果100 μg/ml rhLF細胞處理組24、48、72 h OD值分別為(0.254±0.009)、(0.362±0.011)和(0.422±0.012)，明顯低于其他rhLF細胞處理組；100 μg/ml rhLF細胞處理組24、48、72 h G0/G1期細胞數分別為(63.20±3.48)%、(65.28±4.30)%和(67.38±3.11)%，明顯高于其他rhLF細胞處理組(P<0.05)；隨rhLF濃度和作用時間的增加，G0/G1細胞比例逐漸增大；100 μg/ml rhLF細胞處理組24 h cyclinD1 mRNA相對表達量為(0.21±0.07)，明顯低于其他rhLF細胞處理組(P<0.05)；各細胞處理組p19和p27 mRNA相對表達量無統計學差異(P>0.05)。結論rhLF可降低cyclinD1的表達，抑制Tca8113細胞增殖，有明顯的G0/G1期阻滯作用。

關鍵詞〔〕重組人乳鐵蛋白；口腔癌；細胞周期；調控因子

中圖分類號〔〕R739.8〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：吉林省衛生廳科研課題基金資助項目(No.2012ZC0022)

第一作者：萬英明(1974-)，女，碩士，副教授，主要從事口腔修復學、口腔生物力學研究。

口腔癌患者因其疾病分類不同而表現為不同的臨床癥狀，但通常伴有吞咽困難、語言困難、腫塊、結節、潰瘍、鱗狀斑塊等，如疾病發展至晚期并出現遠端轉移時還可能危及患者生命健康〔1〕。乳鐵蛋白(LF)是乳汁中的一種重要糖蛋白，具有廣譜的抗菌、抗氧化、抗癌及增強機體免疫能力，是新型抗癌藥物之一。本研究旨在分析重組人LF(rhLF)對口腔癌患者Tca8113細胞周期以及其調控因子cyclinD1、p19和p27基因表達的影響及作用機制。

1材料與方法

1.1材料人口腔舌鱗癌Tca8113細胞系，重組人乳鐵蛋白，RMPI1640細胞培養基，cyclin D1、p19、p27單抗，RT-PCR試劑盒，FACSCLIBUR型流式細胞儀。

1.2細胞培養選用上海細胞研究所提供的人口腔舌鱗癌Tca8113細胞系，選用DMEM小牛血清培養，于37℃，5%CO2環境下孵化、傳代。實驗選用接種24 h后的對數生長細胞。

1.3細胞周期檢測取2 ml對數細胞樣本1×106/ml接種于6孔板內，將不同濃度的rhLF滴入孔板內，結束培養。離心，棄上清，洗滌，乙醇固定過夜。離心并收集細胞，將細胞置于RNase A溶液中孵化，選用流式細胞儀檢測結果，并選用細胞周期和軟件ModFit分析。

1.4cyclinD1、p19和p27基因表達檢測不同濃度的rhLF作用對數細胞樣本24 h后，搜集細胞并提取總RNA，PCR反應，條件如下：94℃預變性3 min，94℃50 s，55℃50 s，72℃50 s，32個循環，72℃延伸6 min。選用瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，并選用凝膠圖像分析系統檢測結果。

1.5統計學方法采用SPSS19.0統計軟件進行方差分析。

2結果

2.1細胞增殖活性情況100 μg/ml rhLF細胞處理組24、48、72 h OD值明顯低于其他rhLF細胞處理組(P<0.05)，見表1。

rhLF24h48h72h0μg/ml0.355±0.0020.638±0.0100.857±0.12150μg/ml0.323±0.0050.451±0.0070.605±0.014100μg/ml0.254±0.0090.362±0.0110.422±0.012

F濃度=134.531，F時間=572.09，F濃度×時間=68.157，P均<0.05

2.2細胞周期測定情況100 μg/ml rhLF細胞處理組24 h、48 h、72 h G0/G1期細胞數明顯高于其他rhLF細胞處理組(P<0.05)；隨rhLF濃度和作用時間的增加，G0/G1細胞比例逐漸增大。見表2。

rhLF24h48h72h0μg/ml51.28±3.5652.46±4.2853.08±3.9150μg/ml59.57±2.6161.08±3.1364.13±4.08100μg/ml63.20±3.4865.28±4.3067.38±3.11

F濃度=42.181，F時間=22.542，F濃度×時間=11.264，P均<0.05

2.3cyclinD1、p19和p27基因表達情況100 μg/ml rhLF細胞處理組24 h cyclinD1 mRNA相對表達量明顯低于其他rhLF細胞處理組(P<0.05)；各細胞處理組p19和p27 mRNA相對表達量無統計學差異(P>0.05)。見表3。

rhLFcyclinD1mRNAp19mRNAp27mRNA0μg/ml1.24±0.080.90±0.100.62±0.0950μg/ml0.67±0.040.89±0.110.63±0.10100μg/ml0.21±0.070.88±0.090.62±0.11F/P值45.271/<0.050.242/>0.050.231/>0.05

3討論

LF是一種廣泛分布于哺乳動物組織及分泌液中的非血紅素鐵結合糖蛋白，其中粒細胞具有極強殺菌能力，并可調節人體鐵平衡，加速骨髓細胞的增殖，促細胞生長。此外，LF還具有抗病毒感染，調節免疫，增強人體素質，抑制腫瘤細胞增殖等多種功效，其人工合成物rhLF已被廣泛用于消化道疾病、癌癥等疾病的防治工作中〔2〕。

臨床研究顯示，腫瘤發生、發展與細胞周期調控異常有關。健康細胞的分裂、增殖、凋亡均由各自基因調控，其中G1到S期，G2到M期是細胞周期的兩個關鍵時期，也是腫瘤細胞異常增殖的重要靶時期〔3〕。本研究表明rhLF可通過作用Tca8113細胞G0/G1期生長組織，降低S期細胞，進而抑制腫瘤細胞增殖，并且這種抑制作用與劑量及作用時間呈正相關。有學者選用流式細胞儀檢測rhLF作用后Tca8113細胞DNA含量發現，不同濃度、不同作用時間的rhLF組均出現凋亡峰值，這表明rhLF無法直接誘導腫瘤細胞凋亡，但可以通過阻滯腫瘤細胞周期的來抑制其增殖〔4〕。

cyclinD1是細胞G1期周期素，是細胞由G1期進入S期的關鍵因子，僅在G1期表達為陽性，在G2/M期則變化為陰性。cyclinD1還是腫瘤細胞發生、增殖的重要參與因子〔5〕。cyclinD1低表現提示rhLF可有效抑制口腔癌腫瘤細胞生長，并伴濃度特征。p19是胚胎癌細胞的一種，屬于INK4家族，與多種癌癥疾病發生及細胞衰老有關〔6〕。p19表達水平與蛋白水平相關，具有細胞周期依賴性，在G1期表達水平最低，而在S期表達水平最高。p19對cyclinD1-CDK4活性具有較強抑制作用，但對cyclinE-CDK2則無影響，可介導細胞停滯于G1、G2期〔7〕。p27蛋白是CKI家族成員之一，是臨床公認的一種細胞周期調控負性調控因子，參與著多種腫瘤疾病的發生、發展〔8〕。p27蛋白最早被作為cyclinE-CDK2抑制劑而被發現的，其可表達于靜止細胞內，但如細胞被生長因子刺激，其表達水平將降低。當細胞處于G1期時，p27蛋白可被cyclinD-CDK復合物螯合，當cyclin-CDK水平高于p27蛋白抑制閾值后，細胞得以進入G1期〔9〕。有學者在鹽酸埃克替尼與人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞相關性研究中發現，鹽酸埃克替尼可增強p27蛋白表達，抑制cyclinD1表達，進而誘導細胞停滯于G0/G1期，最終抑制腫瘤細胞增殖〔10〕。而本研究顯示rhLF對口腔癌細胞的阻滯能力與p19和p27蛋白無關。

綜上，rhLF可在體外降低cyclinD1的表達，使口腔癌Tca8113細胞停滯于G0/G1期，進而抑制口腔癌細胞增殖。但目前臨床尚無rhLF與細胞周期特異性藥物聯合治療口腔癌的報道，這可能與rhLF與細胞周期特異性藥物對腫瘤細胞殺傷機制不明有關，有待進一步研究。

4參考文獻

1廖汶曉，閆怡軒，黃艷青，等.塞來昔布增強口腔癌化療敏感性與阻滯周期進程的相關性〔J〕.南方醫科大學學報，2013;33(6):885-8.

2王曉軍，王靜，張力，等.重組人乳鐵蛋白在體外模擬胃腸環境中穩定性研究〔J〕.環境與健康雜志，2012;29(11):992-4.

3烏新林，林凱金，施琳，等.口腔鱗癌淋巴結轉移灶及其原發灶中腫瘤轉移相關因子的表達及臨床意義〔J〕.中華臨床醫師雜志(電子版)，2012;6(21):6792-5.

4張文曉，秦宜德，何曉光，等.乳鐵蛋白抗菌-免疫調節融合肽的載體構建及在大腸桿菌中的表達和純化〔J〕.安徽醫科大學學報，2012;47(6):641-4.

5Kumar P，Modi N，Singh P,etal.Interplay between MEK-ERK signaling，cyclin D1 and cyclin-dependent kinase 5 regulates cell cycle reentry and apoptosis of neurons〔J〕.Mol Biol Cell，2012;23(18):3722-30.

6張振波，張玉英，王雷.重組人乳鐵蛋白對Tca8113細胞中促炎性反應細胞因子IL-6和IL-8蛋白表達的影響〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2011;1(5):805-7.

7李輝，張婷，魯鳳民，等.Plk1與p21WAF1/CIP1在肝細胞癌中的表達〔J〕.臨床肝膽病雜志，2011;27(4):394-6.

8Kim SS，Shetty K,Katuri V，etal.TGF-beta signaling pathway inactivation and cell cycle deregulation in the development of gastric cancer: role of the beta-spectrin，ELF〔J〕.Biochem Biophys Res Comm，2006;344(4):1216-23.

9仇志琴，陶永輝，黃玉政，等.人乳鐵蛋白對卵巢上皮性癌細胞增殖及細胞免疫調節的作用〔J〕.中華婦產科雜志，2012;47(6):467-9.

10吳洋.HIF-1α/VEGF信號通路對口腔癌生物學行為影響及診療意義〔J〕.中國實用口腔科雜志，2012;5(12):713-20.

〔2013-12-19修回〕

(編輯苑云杰)