慢性腎衰竭大鼠血清和尿液血管緊張素原與腎功能指標及病理改變的相關性

慢性腎衰竭大鼠血清和尿液血管緊張素原與腎功能指標及病理改變的相關性

胡天曉牛凱劉冰

(河北省人民醫院腎內科，河北石家莊050051)

摘要〔〕目的研究慢性腎衰竭大鼠血清及尿液血管緊張素原(AGT)與腎功能指標及腎臟病理損傷程度之間的關系。 方法采用5/6腎切除法建立慢性腎衰竭的大鼠模型，測定慢性腎衰進展過程中不同階段的血清肌酐、尿素氮、尿液肌酐、尿蛋白定量情況，并計算肌酐清除率，對腎臟行病理觀察并利用腎小球硬化指數(GSI)、腎小管間質損傷指數(TIS)兩項指標評價損傷程度，同時采用酶聯免疫吸附(ELISA)方法測定血清、尿液的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和AGT水平，分析AGT與各指標之間的相關性。結果血AGT與各項指標均無顯著相關性。尿AGT與Ccr呈顯著負相關(r=-0.667，P<0.01)，與尿AngⅡ呈顯著正相關(r=0.497，P<0.01)，與GSI呈正相關(r=0.545，P<0.05)，與其他指標無顯著相關性。結論尿AGT在一定程度上能夠反映腎功能的情況，并可作為評價腎小球硬化程度的一項無創性指標。

關鍵詞〔〕慢性腎衰竭；血管緊張素原；血管緊張素Ⅱ；病理損傷評價

中圖分類號〔〕R692.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省科技支撐計劃項目(12276104D85)

通訊作者：劉冰(1964-)，男，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事慢性腎臟病的基礎及臨床研究。

第一作者：胡天曉(1987-)，女，在讀碩士，主要從事慢性腎臟病的基礎及臨床研究。

血管緊張素原(AGT)作為腎素-血管緊張素系統的主要組分之一，是腎素的唯一底物，其水平可能能夠反映RAS系統激活的狀態，AGT主要在肝臟合成，肝外組織也有AGT mRNA表達，由于其分子量約為50～60 kD，循環中的AGT不能通過腎小球的濾過膜，腎臟局部的AGT主要是由近端腎小管分泌產生的〔1〕，進一步形成血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，未轉化的AGT隨尿液排出體外，腎內血管緊張素原水平與循環中的水平關系不大。尿液AGT與腎臟疾病狀態的關系如何尚未見報道。本研究通過建立慢性腎衰竭的大鼠模型研究了血清及尿液AGT與腎功能指標及病理改變的相關性。

1材料與方法

1.1動物模型建立選取5～6周齡、體重150～170 g清潔級雄性SD大鼠84只，購自河北省實驗動物中心。大鼠自由飲水,常規飼養。適應性喂養1 w后，隨機分組：假手術組(n=42)和模型組(n=42)。模型組采用經典的Platt法〔2〕進行5/6腎切除術制作慢性腎衰竭模型，手術分Ⅰ、Ⅱ兩期進行。假手術組同期進行手術，均采取同樣步驟，但兩次手術均僅分離腎周脂肪囊及腎蒂，剝離左、右腎筋膜，不做腎切除。

1.2動物分組及取材以Ⅱ期手術結束作為觀察周期的起點，分別于第4、6、8、10、12、14周末的前1 d隨機抽取假手術組、模型組大鼠各6只，禁食，自由飲水，分別置于代謝籠中，收集24 h尿液，記錄總尿量，留存尿液約5 ml，3 000 r/min離心10 min，取上清置于-70℃保存，余尿液立即送檢24 h尿蛋白定量(UP)。于上述各周末以3%水合氯醛腹腔注射麻醉動物后，腹主動脈穿刺取血，收集全血標本約6 ml，3 000 r/min離心10 min，取上層血清置于-70℃保存。假手術組摘取左側腎臟、模型組摘取左側殘腎，沿標本長軸適當切分后，立即投入4%甲醛緩沖液中固定，待行病理切片染色。

1.3觀察指標觀察大鼠精神狀態、活動度、毛發光澤度、攝食及死亡情況。每兩周稱量1次體重，觀察體重變化情況。

1.3.1生化測定采用日本HITACHI 7600-110型全自動生化分析儀測定血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及尿液肌酐(Ucr)。酸沉淀比濁法測定24 h尿蛋白定量。參照文獻〔3〕計算肌酐清除率(Ccr)。

1.3.2腎臟病理檢查對已固定的腎臟組織進行石蠟包埋，行HE、PAS及Masson染色。采用Raij等〔4〕的半定量評分系統評價腎小球的損傷程度，每張PAS染色切片于高倍鏡下觀察40個腎小球，按腎小球受損情況分為0～4級病變。0級：腎小球無硬化；1級：腎小球硬化面積≤25%；2級：25%<腎小球硬化面積≤50%；3級：50%<腎小球硬化面積≤75%；4級：75%<腎小球硬化面積≤100%。計算腎小球硬化指數(GSI)：(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/N×100(N1為評分1級的腎小球個數，N2為評分2級的腎小球個數，N3為評分3級的腎小球個數，N4為評分3級的腎小球個數，N為計數腎小球的總數，即40)。采用Taal等〔5〕的半定量評分系統評價腎小管間質的病變情況。每張Masson染色切片于200倍光鏡下隨機選擇10個不含腎小球的視野。腎小管間質病變由3個參數判定(蛋白管型和小管擴張、間質炎細胞浸潤、間質纖維化程度)，每個參數分別按0～3分評定：無病變0分，輕度受損(受累面積<25%)1分，中度受損(受累面積25%～50%)2分，重度受損(受累面積>50%)3分。每個視野的觀察結果為3個參數評分的總和，10個視野的平均值為腎小管間質損傷指數(TIS)。

1.3.3血清、尿液的AngⅡ和AGT檢測采用酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(Bio-Swamp，中國上海)測定。

2結果

2.1一般情況假手術組大鼠表現機警、反應敏捷，行為正常，皮毛致密整齊有光澤，飲食正常，尿道口無血性分泌物，體重逐漸增加。模型組大鼠精神萎靡、活動遲緩，甚至弓背蜷體，皮毛疏松枯槁無光澤，食量減少，部分動物尿道口可見血性分泌物，大便色質正常，部分大鼠出現大便量減少，體重增加緩慢。隨著觀察周期延長，與假手術組相比，大鼠耳、鼻、足背、尾部皮膚略顯蒼白。處死大鼠時剖腹探查可見個別存在小至中等量腹腔積液。在模型制作過程中，沒有大鼠死亡。術后的觀察周期中，假手術組有2只大鼠死亡，死亡率4.8%。模型組有5只大鼠死亡，死亡率11.9%。經觀察及尸檢，死亡原因為腹腔感染、同伴撕咬、腸管粘連致腸梗阻等。

2.2生化指標及血清、尿液AngⅡ、AGT變化情況模型組UP水平呈逐漸上升趨勢，而假手術組變化不大。Scr、BUN水平自第4周開始較假手術組出現明顯升高，后一度出現回落，大約第10周開始出現逐漸上升趨勢。Ccr在第6周出現明顯下降，第8周時出現輕度上升，之后為逐漸下降趨勢。見表1。血清及尿液AngⅡ水平第4周后出現短暫的下降趨勢，分別自第8周、第10周出現進行性上升。血清AGT水平沒有觀察到明顯的趨勢性變化，尿液AGT自第4周開始逐漸下降，自第8周出現上升趨勢。見表2。

指標組別第4周第6周第8周第10周第12周第14周UP(g/24h)假手術組16.84±6.8233.71±7.0120.04±12.1819.73±7.3923.16±3.9823.46±5.66模型組12.39±3.2322.63±6.961)51.19±6.522)73.42±35.652)62.04±32.131)151.69±94.122)Scr(μmol/L)假手術組64.67±9.7957.62±13.2556.30±5.5862.33±7.2159.43±6.2161.02±7.15模型組79.50±5.322)86.52±4.602)92.68±9.972)87.80±13.772)94.70±12.802)112.50±15.712)BUN(mmol/L)假手術組5.31±1.055.17±0.845.46±0.435.35±0.365.24±0.425.72±0.34模型組9.75±1.102)11.41±2.202)8.72±1.622)10.35±2.192)13.02±2.862)15.33±5.512)Ccr(ml/min)假手術組1.14±0.291.16±0.291.45±0.181.43±0.271.36±0.101.42±0.19模型組0.85±0.260.68±0.102)0.74±0.132)0.75±0.112)0.69±0.242)0.54±0.122)

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

指標組別第4周第6周第8周第10周第12周第14周血AngⅡ(pg/ml)假手術組20.63±4.0134.83±8.5348.34±8.8318.05±7.4520.70±8.4919.32±3.79模型組11.32±6.022)9.23±6.682)4.98±3.272)8.13±4.002)29.81±2.802)33.83±8.592)尿AngⅡ/Ucr(ng/gCr)假手術組16.28±5.2943.96±18.0324.53±10.3411.80±3.5614.64±5.0910.74±3.82模型組54.39±31.502)25.46±8.262)36.48±4.742)27.23±9.672)64.97±5.002)98.94±14.402)血AGT(ng/ml)假手術組5.71±4.099.58±2.565.02±4.146.31±3.457.11±2.897.89±2.90模型組3.32±0.992)4.33±2.382)4.19±3.112)6.59±2.292)3.79±1.872)6.78±2.532)尿AGT/Ucr(μg/gCr)假手術組8.53±1.5018.49±7.1911.66±2.268.79±2.809.60±1.759.93±2.60模型組16.41±11.462)14.89±7.802)7.13±3.172)11.70±7.372)30.89±7.192)18.58±5.372)

2.3病理損傷觀察假手術組大體觀察：各腎外觀及切面正常，離體腎臟呈均勻暗紅色，大小正常，有腎臟質感。光鏡觀察：腎小球結構正常，毛細血管袢開放，基底膜呈線性，無增厚，鮑曼囊囊腔清晰無擴張，球囊無粘連，未見明顯的細胞增殖以及系膜增生；腎小管結構清晰，無萎縮，管腔無擴張，未見蛋白管型，腎間質偶見少量炎細胞浸潤。模型組大體：各期大鼠腎臟均呈淡粉色或灰白色，體積有所增大，有水泡樣光澤，隨觀察周期的延長質地漸硬，無腎臟質感，個別殘腎切面與脾臟或周圍腸管粘連，殘腎剖面偶可見局部血栓形成。光鏡觀察：早期(第6周)：腎小球體積輕度增大，毛細血管袢開放，偶可見基底膜輕度增厚，鮑曼囊囊腔清晰無擴張，球囊無粘連，部分腎小球可見輕度系膜細胞增生；腎小管結構清晰，部分可見腎小管上皮細胞空泡樣變性，局部管腔稍有擴張，未見蛋白管型，腎間質偶可見灶狀炎細胞浸潤。中期(第10周)：腎小球體積增大，毛細血管袢開放，可見基底膜彌漫增厚，鮑曼囊囊腔清晰，可見輕度擴張，部分可見球囊粘連，腎小球可見中重度系膜細胞增生；腎小管結構清楚，部分可見腎小管上皮細胞空泡樣變性及刷毛緣脫落，管腔廣泛明顯擴張，可見大量蛋白管型，腎間質可見大量炎細胞浸潤及廣泛纖維組織增生。后期(第14周)：腎小球體積縮小，可見局灶節段性腎小球硬化，部分小球出現球性硬化，硬化區系膜基質增生，細胞數減少，基底膜廣泛增厚，失去正常線性形態，鮑曼囊囊腔縮小或消失，部分可見球囊局部或廣泛粘連；腎小管多灶狀萎縮，部分囊腔縮小至消失，腎小管上皮細胞空泡樣變性明顯，部分管腔代償性擴張，可見蛋白管型。腎間質可見大量炎細胞浸潤及廣泛重度纖維組織增生。部分小動脈內膜增厚玻璃樣變性，內徑狹窄。見圖1。

2.4腎臟病理損傷評價情況隨著觀察周期的延長，GSI、TIS均大致呈現上升趨勢。GSI在早期為逐漸上升，在第12、14周出現顯著上升；TIS在第8周時出現明顯升高，10 w時稍有下降，后呈逐漸上升趨勢。見表3。

2.5相關性分析以第8周作為慢性腎衰竭的觀察起點，分析血清及尿液AGT與各常規生化檢測指標、血清、尿液AngⅡ及病理損傷指標的相關性，見表4。血AGT與各項指標均無顯著相關性。尿AGT與Ccr呈顯著負相關(r=-0.667，P<0.01)；與尿AngⅡ呈顯著正相關(r=0.497，P<0.01)；與GSI呈正相關(r=0.545，P<0.05)；與其他指標無顯著相關性。

圖1　不同時期模型組大鼠腎小球及小管間質病變情況

指標組別第4周第6周第8周第10周第12周第14周GSI假手術組0.42±1.020.42±1.020.00±0.000.83±1.291.67±1.291.25±0.07模型組2.00±1.001)3.00±2.927.92±6.791)8.75±7.201)18.75±16.111)121.67±62.722)TIS假手術組0.00±0.000.05±0.050.10±0.090.13±0.180.10±0.150.07±0.10模型組0.10±0.130.43±0.381)1.95±1.302)1.27±0.742)2.40±0.862)3.67±1.142)

表4各檢測指標與AGT的相關性分析

指標血清AGTr值 P值尿液AGTr值 P值UTP(g/24h)-0.105>0.050.304>0.05Scr(μmol/L)-0.305>0.050.354>0.05BUN(mmol/L)-0.181>0.050.348>0.05Ccr(ml/min)-0.078>0.05-0.667<0.01血AngⅡ(pg/ml)0.039>0.050.027>0.05尿AngⅡ/Ucr(ng/gCr)0.044>0.050.497<0.01血AGT(ng/ml)0.149>0.05尿AGT/Ucr(μg/gCr)0.042>0.05GSI-0.121>0.050.545<0.05TIS-0.258>0.050.227>0.05

3討論

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAS)是人體內重要的體液調節系統。近年來，大量的研究證據提示腎臟具有不依賴于循環RAS的局部RAS。AngⅡ作為RAS的主要效應分子，參與了一系列生理及病理生理過程，如腎小球灌注壓的增加、腎小球細胞的增殖以及細胞外基質的堆積等，腎臟局部RAS的激活在腎臟疾病的進展過程中發揮了重要的作用。AGT是合成所有血管緊張素多肽所必需的底物，是一種糖基化的球蛋白，主要由肝臟合成〔6〕，由于AGT分子量大，循環中的AGT不能通過腎小球濾過屏障，所以尿AGT主要來源于腎臟，由近端腎小管合成分泌〔7〕，而與循環AGT無關〔8，9〕。其在腎素、ACE等的作用下形成AngⅡ，成為腎內AngⅡ的主要來源，未轉化的AGT隨尿液排出體外。基于AGT的這一代謝特點，近年來引起了人們的關注。Kobori等〔9～11〕研究提示尿AGT與腎內AngⅡ的活性相關，可能是腎內RAS活性的評價指標。章曉燕等〔12〕研究發現慢性腎臟病患者尿AGT水平與腎內AGT、AngⅡ和AngⅡ1型受體的免疫組化染色面積呈正相關，認為尿AGT能較好地反映腎內AngⅡ的活性，可作為腎內AngⅡ活性的無創指標。

臨床上，部分腎臟病人就診時已經不具備腎穿刺活檢的條件，是否存在一種無創的手段或指標來了解和判斷病人腎臟病理變化情況，尤其是對于判斷腎臟病是原發還是繼發于其他疾病的損害時顯得非常重要。本研究顯示血清AGT與各指標間均無顯著相關性，尿AGT與尿AngⅡ呈顯著正相關，這與臨床研究〔12〕的結果相似，結果提示這兩者之間可能存在一定的聯系，由于尿中AngⅡ不僅來源與腎臟局部，還有部分來自于循環中經腎小球濾過后自尿液排出，兩者之間的關系還有待于進一步研究。本研究還發現尿AGT與Ccr呈負相關，這與以往的研究結果〔12〕是一致的，提示尿AGT作為無創性指標，能夠在一定程度上反映腎功能的情況；本研究提示傳統評價腎功能指標對于腎功能預測準確性較差。尿AGT與病理損傷指數的相關性分析發現，尿AGT與GSI呈正相關，與TIS之間并無明顯相關性。關于病理損傷方面，有研究〔12〕發現慢性腎臟病患者尿AGT與尿Ⅳ型膠原呈正相關，由于尿Ⅳ型膠原的水平能夠反映腎臟纖維化的程度，進而推斷尿AGT的水平能夠反映腎臟纖維化的情況，即可能作為腎臟損傷尤其是慢性損傷程度的指標。本研究通過腎臟病理切片直接觀察病變情況，可能較其具有較高的準確性，但結果發現尿AGT與TIS并無明顯的相關性，可能由于TIS本身包含3個方面內容，并不單一反映腎間質纖維化的情況。尿AGT與GSI呈正相關，由于局部RAS系統的激活會導致腎小球血流動力學的改變以及AngⅡ介導的細胞表型改變和細胞增殖，進而調節多種生物活性物質基因表達，這些過程可能都參與腎小球硬化的病理生理進程〔13〕。尿AGT可以作為一個無創性指標反映腎小球硬化的程度，具體的機制以及在人類是否具有類似的相關關系，還值得進一步研究。

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〔2013-11-11修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)