補腎止顫方聯合埋針療法對帕金森病模型大鼠Bcl-2及Bax表達的影響

補腎止顫方聯合埋針療法對帕金森病模型大鼠Bcl-2及Bax表達的影響

胡玉英陳薇1

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院腦病科,廣西南寧530023)

摘要〔〕目的觀察補腎止顫方聯合埋針療法對帕金森病(PD)模型大鼠中腦黑質區Bcl-2及Bax蛋白的影響，探討補腎止顫方聯合埋針療法對PD大鼠神經元細胞凋亡的保護作用。方法采用蛋白酶抑制因子(PSI)皮下注射法制作慢性PD大鼠模型，HE染色觀察各組大鼠中腦黑質區病理形態學改變，免疫組織化學方法檢測Bcl-2及Bax蛋白在中腦黑質區表達的變化。結果PD模型組大鼠Bcl-2及Bax表達均較假手術組明顯增高，中腦黑質區病理改變嚴重；補腎止顫方聯合埋針療法治療后的PD大鼠Bcl-2表達明顯增高，Bax表達明顯降低，中腦黑質區病理變化明顯改善。結論補腎止顫方聯合埋針療法能明顯提高PD模型大鼠中腦黑質區Bcl-2蛋白的表達及抑制Bax蛋白激活，從而抑制黑質細胞凋亡以發揮腦保護作用。

關鍵詞〔〕補腎止顫方；帕金森病；埋針；Bcl-2；Bax

中圖分類號〔〕R742.5〔文獻標識碼〕A〔

1廣西中醫藥大學

第一作者：胡玉英(1970-)，女，副主任醫師，副教授，碩士，碩士生導師，主要從事中西醫結合防治帕金森病、老年期癡呆等。

補腎止顫方由龜鹿二仙膏合大定風珠化裁而來。龜鹿二仙膏具有生精、益氣、養血、陰陽并補，補陰而無凝滯之弊，補陽而無燥熱之害；大定風珠具有育陰潛陽，柔肝熄風功效。而埋針療法治療疾病的記載最早見于《素問·刺要論》：“所謂刺皮無傷肉者，病在皮中，針入皮下，無傷肉也”，它有進針表淺、得效迅速、少用手法、極少痛苦、操作方便、療效持久的特點，具有疏通經絡，調理氣血，平衡陰陽，補瀉虛實功效。補腎止顫方聯合埋針療法則具有滋養肝腎、益精填髓、補氣養血、疏通經絡、熄風止顫之功。本課題組在臨床上運用補腎止顫方聯合埋針療法治療帕金森病(PD)患者，能明顯改善患者的身心健康，使患者運動功能和生活質量進一步提高，取得較滿意療效，但其確切的作用機制并不十分清楚。本研究采用劉雨清等〔1〕蛋白酶抑制因子(PSI)皮下注射法制作慢性PD大鼠模型，通過HE染色觀察各組大鼠中腦黑質區病理形態學改變以及免疫組織化學方法檢測Bcl-2及Bax蛋白在中腦黑質區表達的變化，探討補腎止顫方聯合埋針療法對PD大鼠黑質神經元細胞保護作用的機制。

1材料與方法

1.1動物成年雄性SPF級SD大白鼠32只，體重(250±20)g，由廣西醫科大學實驗中心提供。

1.2藥物及針具①補腎止顫方(由鹿角膠10 g、阿膠10 g、生龜板20 g、黨參15 g、枸杞子30 g、白芍30 g、生地25 g、火麻仁15 g、麥冬15 g、炙甘草6 g、生鱉甲15 g、肉蓯蓉30 g、天麻15 g、黃精10 g、山萸肉10 g、鉤藤30 g組成)，為單味免煎顆粒(由江蘇省江陰市江陰天江藥業有限公司制備，生產批號：1206003)；參照《現代醫學實驗動物學》計算給藥量，藥物配制成含生藥2.574 g/ml，灌胃液體量為每次1 ml/100 g大鼠，其濃度及等效劑量按體表面積折算。②美多巴片由上海羅氏制藥公司提供(批準文號：國藥準字SH10930198，產品批號：SH1443)，每片250 mg；③埋針針具：選取圖釘型無菌撳針針具(蘇州市華倫醫療用品有限公司生產的順和牌無菌撳針，批號：11101)。

1.3主要試劑PSI購自Calbiochem公司；Bcl-2和Bax免疫組化抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；其他試劑均為市售、分析純。

1.4主要儀器組織包埋機和自動組織脫水機(廣州市華俊醫療器械有限公司)，組織切片機(LEICA RM2235)，生物組織烤片機(湖北省孝感市亞光醫學電子技術有限公司)，三用電熱恒溫水溫箱(上海躍進醫療器械廠)，光學顯微鏡(OLYMPUS BX60)。

1.5方法

1.5.1動物篩選大鼠購進后飼以標準的大鼠合成飼料常規飼養，觀察1 w無異常后進行實驗，整個實驗過程中動物自由攝食飲水。實驗期間每日觀察并記錄各組大鼠的體毛、梳理動作、站立次數、肢體震顫、僵直等行為。造模結束后的4w內未出現行為學改變的模型為制作失敗，不納入本實驗，同時術中死亡大鼠及時補充，用同一批次的大鼠制成成功模型后保證實驗動物每組數量不變。

1.5.2埋針處方百會、肝俞、腎俞、舞蹈震顫區。

1.5.3模型制備及分組參照劉雨清等〔1〕PSI皮下注射法。PSI溶液配制方法：將室溫放置的100%無水乙醇直接倒入PSI小瓶中，迅速旋轉溶解，觀察，確定其安全溶解無顆粒殘存，溶解最好在2 min內完成，然后加蒸餾水，稀釋為70%乙醇濃度。制作慢性PD大鼠模型，隔日(每周一、三、五)給予24只大鼠背部皮下注射PSI溶液，75 μl/100 g，連續2 w。將造模成功的大鼠隨機分為3組，即模型組，美多巴組，針藥結合組；另設8只大鼠為假手術組，予同等量的70%乙醇溶液背部皮下注射。各組大鼠在造模結束4 w后進行行為學觀察，根據劉雨清造模成功標準〔1〕篩選合格的PD大鼠(活動減少，運動遲緩，重心降低，肢體僵硬)。各組在造模4 w后連續給藥3 w，假手術組、模型組均予1 ml·100 g-1·d-1生理鹽水灌胃；美多巴組予美多巴200 mg·kg-1·d-1灌胃；針藥結合組予補腎止顫方溶液1 ml·100 g-1·d-1灌胃，同時予埋針療法，隔天(每周一、三、五)治療，連續3 w，最后每組8只大鼠進行實驗。各組大鼠灌胃給藥3 w后，予10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)經腹腔注射深度麻醉大鼠后仰臥固定于手術臺上，暴露心臟，止血鉗夾住腹主動脈及下腔靜脈，用磨頓的10號針頭刺入左心室，先快速滴入生理鹽水約100 ml，若大鼠兩前肢及兩肺變白改灌注4%多聚甲醛(0.1 mol/L，pH 7.4)100 ml，灌洗后快速斷頭取大腦，置于4%的多聚甲醛中固定、脫水、透明并石蠟包埋備用。

1.6觀察指標

1.6.1動物行為學觀察實驗期間每日觀察并記錄各組大鼠的體毛、梳理動作、站立次數、肢體震顫、僵直等行為。

1.6.2中腦黑質區病理改變的觀察常規HE染色，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠中腦黑質區細胞形態學改變。

1.6.3中腦黑質區Bcl-2、Bax蛋白表達的測定采用免疫組織化學染色法SABC法〔2〕檢測各組大鼠中腦黑質區Bcl-2、Bax蛋白表達的變化，在光學顯微鏡高倍鏡下隨機取2 mm×2 mm視野，計算中腦黑質區的Bcl-2、Bax的陽性細胞數，并采用HMIAS-2000高清晰彩色病理圖像分析系統對免疫組化切片進行圖像分析，測定Bcl-2、Bax免疫組化染色的陽性細胞數。

1.7統計學方法采用SPSS17.0統計軟件包進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2結果

2.1動物行為學觀察造模大鼠注射PSI結束后，逐漸出現不自主咀嚼，站立次數、梳理動作增多；PSI注射結束后第4周癥狀較明顯，大鼠主要表現為采食量減少、毛發粗糙無光澤、污穢，前爪出現顫抖，行走時重心明顯降低，伸展姿態時腹部接觸地面，運動遲緩，肢體的伸展緩慢。

2.2中腦黑質區病理變化各組大鼠中腦黑質區HE染色后光鏡下觀察，可見假手術組中腦黑質區神經元細胞排列整齊密集，形態正常；模型組細胞膜出現明顯皺縮，細胞體積明顯縮小，胞質明顯減少，核膜不完整，神經細胞數量明顯減少；而美多巴組和針藥結合組中腦黑質區病理變化與模型組比較均有不同程度的改善。見圖1。

2.3Bcl-2及Bax蛋白表達Bcl-2、Bax蛋白表達部位在黑質細胞的胞質。與假手術組比較，模型組、美多巴組以及針藥結合組Bcl-2及Bax表達均明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，美多巴組和針藥結合組Bcl-2表達亦明顯增高，Bax表達明顯降低(P<0.01)；而針藥結合組與美多巴組比較，則針藥結合組Bcl-2表達明顯增高，Bax表達明顯降低(P<0.05)。見表1。

假手術組

模型組

美多巴組

針藥結合組

組別視野Bcl-2Bax假手術組1618.04±0.7214.79±0.80模型組1626.23±1.311)42.02±0.831)美多巴組1635.85±0.811)2)32.10±0.441)2)針藥結合組1643.90±1.051)2)3)20.99±0.741)2)3)

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與美多巴組比較：3)P<0.05

3討論

流行病學調查顯示，目前65歲以上人群中約有百分之一患PD〔3〕。被譽為治療PD藥物“金標準”的左旋多巴制劑，其治療的“蜜月期”僅3～5年，且其療效僅僅是癥狀緩解，不能阻止或延緩神經元丟失的發展，長期使用則出現療效衰減、癥狀波動、運動障礙等，臨床應用受到極大限制〔4〕，因此有必要尋求更有效的治療方法和藥物。

目前PD發病機制尚未完全明確，研究認為與線粒體功能障礙、氧化應激過度、細胞凋亡等因素相關，但無論是哪種發病機制，最終均表現為黑質致密部多巴胺(DA)能神經元的凋亡。細胞凋亡在PD的黑質DA能神經元死亡中起重要的作用，而參與調控神經元細胞凋亡的基因和蛋白質產物中，蛋白家族Bcl-2和Bax在細胞凋亡過程中發揮著至關重要的作用。本實驗說明PSI有導致黑質細胞凋亡的作用，從而使DA神經元減少，最終導致PD的發生。

Bcl-2蛋白是一種膜定位蛋白，具有抑制多種細胞發生凋亡的作用，存在于細胞的線粒體、核膜、內質網膜上〔5〕。它作用于線粒體滲透性轉換孔，通過改變線粒體膜的通透性來調節PD細胞凋亡〔6〕，其蛋白表達的增加能減少黑質DA神經元凋亡的作用。Bax蛋白是促細胞凋亡蛋白，它是黑質細胞凋亡的關鍵啟動因素，Bax蛋白作為前凋亡蛋白在啟動和誘導黑質細胞凋亡方面起著關鍵性的作用〔7〕，它既能和形成異源二聚體使Bcl-2蛋白失活，對細胞凋亡有促進作用，又可以自身形成同源二聚體，直接促進凋亡。有研究表明〔8〕，在PD早期采取積極措施，促進Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達，調節細胞凋亡發生的早期環節，阻斷病理生理變化向惡性方向發展，可以減輕或消除DA氧化應激引發的神經系統損傷。本實驗結果提示補腎止顫方聯合埋針療法能明顯抑制Bax蛋白表達及促進Bcl-2蛋白表達，對黑質細胞具有明顯保護作用，使DA能神經元凋亡明顯減少，從而改善PD癥狀、延緩PD進展。

本結果表明補腎止顫方聯合埋針療法可明顯減輕PSI造成的中腦黑質區細胞凋亡，對DA能神經元具有修復及保護作用，從而促進PD大鼠運動功能的恢復。

總之，本研究表明補腎止顫方聯合埋針療法對PD中腦黑質區細胞凋亡有明顯抑制作用，其作用機制可能是通過提高Bcl-2蛋白表達及抑制Bax蛋白激活，從而抑制神經細胞凋亡，修復及保護DA能神經元，從而改善PD臨床癥狀、延緩PD進展。本實驗為補腎止顫方聯合埋針療法臨床治療PD患者提供了可靠的實驗依據。

4參考文獻

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〔2013-11-06修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)