缺氧損傷模型中胰島素樣生長因子-1對少突膠質(zhì)前體細胞自噬和增殖能力的影響

缺氧損傷模型中胰島素樣生長因子-1對少突膠質(zhì)前體細胞自噬和增殖能力的影響

劉洋許婧1周韜1陳松伊超馬春杰沈雷2

(齊齊哈爾醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江齊齊哈爾161006)

摘要〔〕目的探討胰島素樣生長因子(IGF)-1對缺氧性少突膠質(zhì)前體細胞損傷的修復機制。方法分離提純Wistar大鼠少突膠質(zhì)前體細胞，設立正常對照組、缺氧組、缺氧IGF-1組，MTT法觀察細胞增殖，Western印跡法檢測LC-3蛋白表達。結(jié)果分離提純的細胞符合少突膠質(zhì)前體細胞鑒定標準；缺氧IGF-1組細胞增殖OD值比缺氧組提高1.3倍(P<0.05)；缺氧IGF-1組少突膠質(zhì)前體細胞LC-3的表達逐漸上升，90 min后呈逐漸降低的趨勢。結(jié)論IGF-1通過增加保護性自噬機制，促進少突膠質(zhì)前體細胞的增殖，對修復神經(jīng)損傷具有重要意義。

關鍵詞〔〕少突膠質(zhì)前體細胞；胰島素樣生長因子-1；自噬；缺氧

中圖分類號〔〕R74〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：齊齊哈爾市科學技術(shù)計劃社會發(fā)展項目(No.SFGG-201230)

1齊齊哈爾醫(yī)學院2013級實驗班

2齊齊哈爾醫(yī)學院解剖教研室

第一作者：劉洋(1975-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科醫(yī)療研究。

腦白質(zhì)中數(shù)量最多的少突膠質(zhì)細胞對缺氧損傷比較敏感〔1〕，缺氧等是導致少突膠質(zhì)細胞損傷而產(chǎn)生腦白質(zhì)病變的主要因素〔2〕。近年來研究〔3〕發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布著少突膠質(zhì)細胞前體細胞(OPC)，在體外培養(yǎng)OPC具有自我更新增殖和不對稱分化的能力，說明OPC是具有干細胞或干細胞樣特性的細胞，是少突膠質(zhì)細胞的前體類神經(jīng)干細胞。所以，少突膠質(zhì)細胞的損傷有可能通過促進OPC的分化而達到逆轉(zhuǎn)腦白質(zhì)病變的作用。胰島素樣生長因子(IGF)-1對神經(jīng)干細胞生長具有促進作用〔4〕，但是關于IGF-1對OPC的作用研究比較少。深入闡述缺氧模型條件下IGF-1對OPC的增殖、自噬和凋亡的影響，可以為探尋以OPC為靶點治療腦缺氧缺血性疾病的方法提供研究基礎。

1材料與方法

1.1OPC的培養(yǎng)動物實驗獲得齊齊哈爾醫(yī)學院倫理委員會同意。按文獻〔5〕記載的方法培養(yǎng)出生72 h內(nèi)Wistar 大鼠(齊齊哈爾醫(yī)學院動物實驗中心)的腦組織中OPC。

1.1.1膠質(zhì)混合細胞的培養(yǎng)按照Armstrong〔6〕的細胞培養(yǎng)流程。取0～3日齡Wistar大鼠幼崽，斷頭處死，取除去小腦的全腦組織，并置于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中。除去內(nèi)層和外層腦膜后，依次通過尼龍網(wǎng)孔眼為125 μm和36 μm的細胞篩，900 r/min，離心10 min，把細胞懸液重懸于5 ml膠質(zhì)混合培養(yǎng)基〔按1∶1比例混合DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基(均購自美國Gibco公司)，并添加10%胎牛血清(美國Gibco公司)，100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素(碧云天，杭州)〕。將得到的懸浮液接種在細胞培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)。

1.1.2OPC分離培養(yǎng)〔7〕在細胞培養(yǎng)箱中，以180 r/min速度搖動細胞培3 h后，用0.01 mol/L PBS溶液洗滌1次，然后添加新鮮的膠質(zhì)混合培養(yǎng)基，再繼續(xù)搖晃18 h后，將上清液按1 700 r/min速度離心5 min，種植在涂布著5 μg/ml聚-L-賴氨酸的培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃，5%CO2培養(yǎng)45 min；取上清液，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，再重懸于1 ml膠質(zhì)混合培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)。

1.2少突膠質(zhì)細胞的鑒定取純化培養(yǎng)10 d的OPC細胞，4%多聚甲醛室溫固定 20 min；10%山羊血清封閉 50 min；滴加兔抗大鼠A2B5抗體(1∶300，Santa Cruz，美國)，4℃過夜；次日滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗兔IgG(1∶200，Santa Cruz，美國)，37℃避光1 h；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物緩沖液(DAKO)水溶性封片液封片；熒光顯微鏡下觀察。

1.3缺氧模型制作以及實驗分組用含10 mmol/L Na2S2O4(四川科龍，成都)的膠質(zhì)混合培養(yǎng)基培養(yǎng)OPC，建立缺氧模型〔4〕，或在缺氧細胞模型中添加100 mmol/L IGF-1(Sigma，美國)，分為正常對照組、缺氧組、缺氧IGF-1組。2×104細胞貼壁后30、60、90 min為觀察點。

1.4MTT細胞增殖實驗按少突膠質(zhì)前體細胞分組情況，1×104細胞/孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)48 h，每孔加入噻唑藍(MTT)(20 μl，5 mg/ml，Sigma)，37℃，5%CO2孵育4 h，更換二甲基亞砜(DMSO)(150 μl，Sigma)，使用Emax酶標儀(Molecular Devices)，490 nm波長測定每個樣品吸光度(OD值)。

1.5Western印跡法檢測少突膠質(zhì)前體細胞中自噬標記蛋白(LC)-3表達使用多能干細胞(IPs)細胞裂解液(碧云天生物公司，福州)裂解細胞，并提取各組細胞的總蛋白；凝膠電泳；將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜(Millipore,美國)，5%牛血清白蛋白(Santa Cruz，美國)封閉2 h，在4℃條件下，兔抗鼠LC-3(1∶200，Santa Cruz，美國)孵育12 h，然后以山羊抗兔IgG(1∶150,Santa Cruz，美國)和超敏化學發(fā)光法(ECL)試劑盒(碧云天生物公司，福州)進行免疫印跡分析，β-actin為上樣對照。IPP軟件分析圖像光密度值差異。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0軟件進行t檢驗或方差分析。

2結(jié)果

2.1OPC的培養(yǎng)和鑒定分離OPC胞體較大，呈卵圓形團狀生長，伸出1～2個長突起，向四周發(fā)散，細胞增殖不明顯；分離培養(yǎng)的OPC A2B5抗體染色陽性。見圖1。

2.2IGF-1對OPC增殖的影響缺氧組細胞增殖OD值較正常組降低(P<0.05)；而缺氧IGF-1組細胞增殖OD值比缺氧組提高1.3倍(P<0.05)。見表1。

2.3LC-3表達結(jié)果缺氧IGF-1組OPC從培養(yǎng)時，LC-3的表達逐漸上升，60 min達高峰，90 min呈現(xiàn)降低趨勢；缺氧組和缺氧IGF-1組各時間點LC-3比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖 2，表2。

藍色：DAPI標記；綠色：FITC標記A2B5抗體 圖1　A2B5在少突膠質(zhì)前體細胞的表達(標尺=150 μm)

組別30min60min90min正常組0.553±0.2780.981±0.1230.854±0.210缺氧組0.301±0.9591)0.712±0.3471)0.623±0.3211)缺氧IGF-1組0.456±0.2702)0.926±0.9832)0.795±0.1902)

與正常組比較：1)P<0.05，與缺氧組比較：2)P<0.05

圖2　Western印跡法檢測缺氧組和缺氧 IGF-1組不同時間點LC-3表達變化

組別30min60min90min缺氧組0.523±0.0750.468±0.0850.610±0.046缺氧IGF-1組0.312±0.0411)0.937±0.0631)0.783±0.0621)

與缺氧組比較：1)P<0.05

3討論

腦室周圍白質(zhì)軟化癥(PVL)是老年人好發(fā)的腦白質(zhì)病，危害患者生命和家庭幸福〔8〕。目前認為，缺氧缺血是導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因〔9〕。腦白質(zhì)中含有大量少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等膠質(zhì)類細胞，其中少突膠質(zhì)細胞對缺氧損傷最為敏感〔10〕，因此認為缺氧導致的腦白質(zhì)疾病可能是通過損傷少突膠質(zhì)細胞而引起的〔2〕。OPC屬于多能干細胞，在體外一定誘導因素的作用下，OPC分化成星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的潛能，對神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復將會發(fā)揮具有重要作用。

OPC會分化產(chǎn)生成熟的少突膠質(zhì)細胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中形成軸突髓鞘的主要成分，如果少突膠質(zhì)細胞病變損傷就會發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病。本文培養(yǎng)的細胞體積不大，由開始的雙極細胞形，逐漸在胞體周圍出現(xiàn)細小突起，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞突起逐漸增多，并成2、3級分支，相鄰的細胞之間突起相連，形成接觸面(點)，在外觀上符合OPC的形態(tài)特點。研究認為，OPC的鑒定除了形態(tài)指標外，還可以使用免疫染色、定量實時PCR或Western印跡等技術(shù)檢測OPC表面A2B5、NG2等特異性抗體進行標記鑒定〔11〕。也有科學家通過miRNA技術(shù)下調(diào)少突膠質(zhì)細胞標志物A2B5、NG2〔12〕，抑制OPC分化而確定OPC的培養(yǎng)結(jié)果。本文通過免疫組織化學的方法熒光標記證明培養(yǎng)的細胞屬于OPC，與其他學者研究一致，也為進一步實驗奠定了實驗基礎。

目前已知神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)、白血病抑制因子(LIF)等許多生長因子均參與或維持OPC的增殖與存活〔13〕。其中血小板源性生長因子(PDGF)-α、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)〔14〕、神經(jīng)生長因子(NT)-3〔15〕和IGF-1〔16〕等4種多肽因子與OPC的增殖密切相關。

IGF-1屬于IGF家族的成員〔17〕，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要調(diào)控因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和分化中具有重要作用；IGF-1具有減少損傷神經(jīng)元死亡、促進突起生長和突觸形成的作用〔18〕。IGF-1是體內(nèi)少突膠質(zhì)前體細胞生長需要的重要生長因子，IGF-1參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，對神經(jīng)元的再生和修復過程〔19〕。本實驗尚發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，使用IGF-1刺激OPC可以促進該細胞增殖，也驗證了IGF-1是能夠促進OPC增殖的營養(yǎng)因子。本實驗認為，對于老年性腦白質(zhì)疾病，有可能通過使用IGF-1通過刺激OPC可以促進該細胞增殖，逆轉(zhuǎn)老年腦白質(zhì)脫髓鞘性疾病的癥狀。

自噬參與去除、回收多余的或損壞的細胞器和細胞質(zhì)，是細胞生存、分化、發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境動態(tài)平衡至關重要的現(xiàn)象〔20〕。本實驗觀察到，缺氧條件下，IGF-1刺激的OPC自噬現(xiàn)象明顯，而凋亡呈現(xiàn)降低變化，這可能是由于OPC在IGF-1影響下，分泌NGF、VEGF等細胞因子〔21〕，BDNF 與其特異性受體TrK B結(jié)合通過Ras能激活PI3K途徑〔22〕，激活的PI3K可改變質(zhì)膜小葉內(nèi)磷脂肌醇的構(gòu)成，進一步導致Akt 蛋白激酶 B 易位到質(zhì)膜，激活PI3K/Akt/mTOR通路這一調(diào)節(jié)自噬的經(jīng)典途徑〔23〕。激活的保護性自噬行為，可以防止線粒體等細胞器氧化損傷〔24〕。細胞自噬表達升高，降解因為缺氧而引起的結(jié)構(gòu)或功能異常的細胞，產(chǎn)生的氨基酸或ATP可以被其他細胞繼續(xù)利用，這種自噬現(xiàn)象是生物進化形成的保護機制〔25〕。說明IGF-1促進OPC的增殖有可能通過增加自噬途徑而實現(xiàn)，當然，相關的機制研究還需要深入探討。

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其次，在雙創(chuàng)教育師資團隊建設方面，學校應積極重視打造一支由學校骨干教師和企業(yè)專家組成的優(yōu)秀創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)導師隊伍。由于來自“學院派”的校內(nèi)導師缺乏在企工作經(jīng)歷和項目合作案例，導師隊伍結(jié)構(gòu)中來自校外背景的人員應多些。校外導師的聘用途徑包括：一是從已畢業(yè)的往屆優(yōu)秀校友中選擇一批擁有成功創(chuàng)業(yè)歷程和經(jīng)驗的；二是與當?shù)卣蛣?chuàng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園區(qū)合作，甄選出社會責任感強的、經(jīng)營管理經(jīng)驗豐富的企業(yè)專家。

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〔2014-03-12修回〕

(編輯袁左鳴)