Plackett-Burman試驗、最速上升試驗及Box-Behnken試驗聯用優化梔子多酚超聲提取工藝

黃 瀟 肖 雄 高文軍 陳 瑤

江西中醫藥大學藥學院，江西南昌 330004

梔子為常用中藥，在我國應用歷史悠久，歷代主要本草著作中均有收錄。國內外從19世紀末開始對梔子屬植物進行大量化學成分方面的研究［1-5］，目前為止，從梔子中發現了大量的多酚類化合物。多酚類化合物是一類復雜的具有多個酚羥基的次生代謝產物，具有抗氧化性［6］、清除自由基、降血脂、降血壓、降血糖［7-8］、抗腫瘤［9-10］、抗衰老、鎮痛、抗炎、抗菌等作用［11］。

近年來，響應面優化法在中藥提取工藝、中藥制劑工藝、中藥處方篩選中已有大量應用［12］，而Placket-Burman試驗可從大量影響因子中篩選出顯著因子，最速上升試驗又可將顯著因子最大程度逼近中心點，故此在優選響應面顯著因子方面最為準確有效［13］。本研究利用Placket-Burman試驗篩選出乙醇濃度、液料比、提取時間三個顯著因素、采用最速上升試驗確定響應面分析的中心點，最終通過Box-Behnken試驗響應面分析，優化了梔子總多酚的超聲提取的工藝，為梔子的開發利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子（江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司），經江西中醫藥大學范崔生教授鑒定為梔子（Gardenia jasminoidesEllis）的果實，烘干，粉碎，過篩，備用。

沒食子酸標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號110813-201204），95％乙醇、85％濃磷酸、37％濃鹽酸（汕頭市西朧化工有限公司），無水碳酸鈉、硫酸鋰、溴水（天津市風船化學試劑科技有限公司），鉬酸鈉、鎢酸納（天津市化學試劑四廠）所有試劑均為分析純。Folin-Ciocalten（FC）試劑：參照文獻［14］自配。

1.2 實驗儀器

KQ-300超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-4數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），0412-CENTRIRIFUGE離心機（上海方術器械廠），BS224S電子天平（北京塞多利器有限公司），YF-116搖擺式粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司），UV-2100紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 沒食子酸標準曲線繪制 稱取沒食子酸標準品10mg，用80％乙醇定容至100mL容量瓶。分別移取沒食子酸標準品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL于10mL容量瓶，加水至4.0mL后，加入2mL FC試劑搖勻，靜置5min；再加入10％碳酸鈉溶液2mL，用水定容至刻度，搖勻，避光放置2h，以80％乙醇溶液作空白組，于波長764nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，沒食子酸濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=0.095X-0.103，相關系數R2=0.9980。

1.3.2 梔子總多酚的測定方法［15］精密稱取梔子粉末0.5g，在一定條件下超聲提取，定容至20mL，取一定量上清液于10mL容量瓶，加水至4.0mL，先加入2mL FC試劑，搖勻，靜置5min；再加入2mL 10％碳酸鈉溶液，用水定容至刻度，搖勻，避光放置2h，以試劑作空白組，測定其在波長764nm處的吸光度，通過沒食子酸標準曲線計算所測樣品的濃度，按下式計算梔子總多酚含量，每組試驗平行3次。

總多酚含量（％）=提取出的多酚類化合物量/梔子量×100％。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman（PB）試驗

PB試驗是一種通過N次試驗可以研究最多K=N-1個變量（N一般為4的倍數）的兩水平的實驗設計方法，能夠通過比較各因素兩水平的差異與整體的差異來確定其顯著性，從而達到篩選顯著因素的目的，可以避免在之后的優化試驗中由于因素太多或部分因素不顯著而造成的試驗成本浪費［16-17］。

考察梔子總多酚超聲提取的7個影響因素，各因素以及水平的選擇來源于單因素預實驗：X1為乙醇濃度、X2為粒徑、X3為液料比、X4為超聲功率、X5為提取溫度，X6為提取時間，X7為提取次數，X8為虛構變量用以估算誤差。每個因素分別選取高水平（1）和低水平（-1），以梔子總多酚提取率為響應值，用Design-Expert.8.05b軟件設計試驗并進行數據處理。PB試驗設計因素及水平編碼見表1，實驗設計及響應值見表2，方差分析見表3。

表3 Plackett-Burman試驗設計方差分析表

Design-Expert.8.05b軟件擬合出多項式方程如下：

Y=-1.41+1.6×10-2X1-9.2×10-2X2+1.6×10-2X3+3.5×10-3X4+2.9×10-3X5+1.3×10-2X6+2.6×10-2X7

由表3可以看出，模型R2=0.9788，表明有97.88％試驗數據的差異可用該模型解釋。R2

adj=0.9418與R2接近，能夠更好的看出模型的解釋力。各因素對響應值的影響由P值決定，P＜0.05時，該因素對總多酚的提取為顯著因素，反之不顯著。表3及擬合多項式可以看出，乙醇濃度X1、料液比X3、提取時間X6為顯著因素，對提取率的影響均為正相關，顯著程度為X3＞X1＞X6。

2.2 最速上升試驗

最速上升試驗，又叫最陡爬坡試驗，能夠快速的將各因素水平趨近最優響應值，最終建立有效的響應面擬合方程［18］。根據PB試驗的結果，進行最速上升試驗。由PB試驗結果可知，乙醇濃度、料液比、提取時間對梔子總多酚得率有顯著影響，因此按這三個因素效應的大小比例設定最速上升路徑和步長。乙醇濃度、料液比、提取時間的均為正相關，三因素的水平均為遞增，試驗設計和結果見表4。由表4可知，梔子多酚得率最大值在試驗4附近，因此選擇試驗4中各參數值為后續Box-Behnken試驗的中心點。

表4 最速上升實驗設計及結果

2.3 Box-Behnken試驗

采用Box-Behnken響應面試驗法，將乙醇濃度、液料比、提取時間三因素取三水平，編碼及水平見表5，試驗設計及結果見表6，方差分析見表7。

表5 Box-Behnken試驗因素及水平

表6 Box-Behnken試驗設計及結果

Design-Expert.8.05b擬合出多項式方程如下：

Y=-24.35+0.47A-0.35B+0.64C+1.0×10-4AB-2.6×10-3AC-3.05×10-18BC-4.29×10-3A2-7.09B2-7.39C2

表7中，P＜0.05表明模型或考察的因素有顯著影響。模型的P＜0.0001，表明模型顯著性很高；模型失擬項P值為0.1097，大于0.05，表示失擬項不顯著；模型的R2=0.9971，R2adj=0.9934，表明模型的相關性和解釋度都很好。表7的結果中，由P值大小來判斷，乙醇濃度A、料液比B、提取時間C三個因素對響應值的大小影響為B＞A＞C，同時AC、A2、B2、C2的P值均＜0.05，對響應值有顯著影響。

圖1為Design-Expert.8.05b軟件擬合的二次回歸響應面3D圖，結合表7結果可以看出乙醇濃度、料液比、提取時間兩兩因素的交互作用對響應值的影響，PAC＞PAB＞PBC，響應值存在極值，經Design-Expert.8.05b進一步計算得出：當乙醇濃度為44.53％，液料比25.26mL/g，提取時間為35.28min時，梔子總多酚提取率有最大值，為1.9％。

2.4 驗證試驗

為檢驗Box-Behnken響應面優化模型的可靠性，依據實際情況，將提取條件調整為乙醇濃度45％，液料比25mL/g，提取時間為35min，平行試驗3次，取平均值，得到實際提取率為1.857％，與預測值1.9％接近，表明采用Box-Behnken響應面優化的梔子總多酚超聲提取模型準確可靠。

表7 Box-Behnken實驗結果方差分析表

圖1 各因素兩兩因素的交互作用對多酚提取率影響的響應面圖

3 結論

本研究采用PB試驗法、最速上升試驗法、和Box-Behnken試驗法，確定影響梔子總多酚超聲提取率3個顯著因素為乙醇濃度、液料比、提取時間，在最佳工藝條件：乙醇濃度為44.53％，液料比25.26mL/g，提取時間為35.28min下，梔子總多酚得率預測值為1.9％。依據實際情況將最佳工藝條件調整為乙醇濃度45％，液料比25mL/g，提取時間為35min，經驗證試驗表明，此條件下梔子總多酚得率為1.857％，與預測值1.9％接近，表明了響應面模型的可靠性和準確定性，為梔子做為天然抗氧化劑來源的開發和利用提供了參考。

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