二氯乙酸鈉在豬精液冷凍保存中的應(yīng)用效果

楊寶衛(wèi) ，周運和 ，陳祥林 ，李彩萍 ，胡傳活

（1.廣西水產(chǎn)畜牧學(xué)校，廣西 南寧 530021；2.廣西大學(xué)動物科技學(xué)院，廣西 南寧 530005）

自從1956年P(guān)olge[1]等開始進行豬精液冷凍試驗后，很多國家都相繼開展了該項技術(shù)的研究。但是，豬精子對外界溫度變化比較敏感，冷凍、解凍過程中極易受到損傷，導(dǎo)致豬凍精生產(chǎn)難度大。經(jīng)過幾十年的不懈研究和改良，雖然凍精生產(chǎn)的技術(shù)已有很大的進步，但凍后精液的受胎率、窩產(chǎn)仔數(shù)還是不如常溫液態(tài)精液好。目前全球利用豬凍精進行人工授精的比例不到人工授精總數(shù)的1%[2]。

二氯乙酸鈉（DCA）在豬精液保存中的應(yīng)用研究較少，因此本研究在傳統(tǒng)稀釋液的基礎(chǔ)上添加了DCA，以分析此種試劑對豬精子凍后質(zhì)量的改善有無作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備 N-乙酰半胱氨酸（NAC）、MLT購自Sigma公司，DCA購自武漢一化工有限公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris）由Amersco公司分裝，新鮮精液由廣西科達畜禽改良有限責(zé)任公司提供；自動化精液冷凍儀由法國IMV卡蘇科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗步驟

1.2.1 精液采集、稀釋與平衡 用手握法采精，選用精子活力60%以上的精液。將精液放入離心機內(nèi)，以2000r/min離心5min。去掉適量上清液，吹打均勻，待用。用試管取離心后的精液適量，按1∶1比例分兩次（間隔15min）加入冷凍稀釋液（配方見表1，參考李剛等[3]及魏世寶[4]的資料來配制），吹打均勻，用0.25mL塑料細管分裝，作好標(biāo)記，放入冰箱中5℃下平衡4h。

表1 豬精液冷凍稀釋液配方

1.2.2 精液的冷凍與解凍 將細管取出，檢查平衡后活力，放入精子程序降溫儀內(nèi)冷凍：開始溫度為5℃，降至-5℃的降溫時間約為3.8 min，降溫速度約為2.6℃/min；從-5℃下降至終止溫度-134℃的降溫時間約為5.2min，降溫速度約為24.8℃/min；程序運行結(jié)束后，馬上將細管投入液氮。至少5min之后，將細管放入電子恒溫水浴鍋內(nèi)解凍（40℃，4～6s），鏡檢。

1.2.3 精子的畸形率、頂體完整率檢查 參照江一平等[5]報道的方法用考馬斯亮藍R250染色液對精子進行染色，然后在1000×顯微鏡下檢查精子畸形率和頂體完整率。每個處理抹片2張，每片記數(shù)200個以上的精子。

1.3 試驗設(shè)計 按二氯乙酸鈉（DCA）在稀釋液中的濃度分為 0、1、0.1、0.01mmol/L 4 組，試驗重復(fù) 5 次。檢測指標(biāo)為凍后精子的畸形率及頂體完整率。

1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件進行處理，然后用SPSS13.0軟件ANOVA法進行方差分析，用Duncan法進行多重比較，檢驗差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

從表2可見，當(dāng)DCA濃度為1 mmol/L時，凍后精子的畸形率和頂體完整率與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)DCA濃度降低時，這兩個指標(biāo)顯著差于對照組（P＜0.05）。說明在冷凍稀釋液中添加DCA對凍后精子的畸形率和頂體完整率沒有改善作用。

表2 二氯乙酸鈉對凍后精子的畸形率和頂體完整率的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 DCA的作用 近來有研究發(fā)現(xiàn)，DCA作為一種廉價的用于治療新陳代謝紊亂的藥物，可以殺死癌細胞并對腫瘤的生長有一定的抑制作用，還可通過促進乳酸氧化、降低血液乳酸水平、改善機體的代謝平衡來治療一些代謝性疾病，如先天性或代償性乳酸酸中毒。在組織缺氧情況下（比如激烈運動造成的組織缺氧及高乳酸水平），DCA可通過增加氧攝取、激活丙酮酸脫氫酶復(fù)合物，促進乳酸氧化來補充能量供應(yīng)，從而改善缺氧組織的能量代謝狀況。目前已經(jīng)作為藥物進行研究的二氯乙酸鹽，包括其鈉鹽、二異丙胺鹽、二氯乙酸酯和離子化合物，用于臨床的只有DCA。已報道的二氯乙酸鹽代謝產(chǎn)物包括：乙氯乙酸、乙醛酸、乙醇酸、乙二酸、二氧化碳和甘氨酸。

臨床研究顯示，與碳酸氫鈉相比，DCA不但能夠緩解酸中毒，而且能夠改善血液動力學(xué)指標(biāo)，降低外周血管阻力，并對腦出血有保護作用。DCA還能提高氧的利用度，毒副作用的發(fā)生率不高。在已經(jīng)進行的各項臨床試驗中，不管使用DCA的劑量大小或時間長短，均未見有關(guān)致癌、致突變的報道。正常細胞的能量供給主要來自于葡萄糖代謝，通過線粒體依賴的糖氧化和糖酵解兩種方式供應(yīng)三磷酸腺苷。惡性腫瘤細胞在氧充足的條件下，糖酵解代謝同樣非常活躍，腫瘤細胞可以從活躍的糖酵解代謝中獲益[7]。糖酵解過程可產(chǎn)生大量乳酸，導(dǎo)致腫瘤細胞微環(huán)境酸化，酸化的微環(huán)境對腫瘤細胞可能造成生長抑制，但腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個不斷變異選擇的過程，當(dāng)耐酸的腫瘤細胞株優(yōu)勢選擇形成，酸化的微環(huán)境則對腫瘤細胞有著保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解酶具有拮抗細胞凋亡的功效，可導(dǎo)致惡性腫瘤對化療和放療等促凋亡作用的耐受。如己糖激酶能與線粒體特異結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)作用，激活的己糖激酶從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜，與線粒體膜交互作用，抑制了一些線粒體依賴的細胞凋亡的關(guān)鍵部分，從而增加細胞對凋亡的抵抗。近來有研究表明，這種過多的糖酵解很可能造成細胞對凋亡的抵抗。

3.2 作用機理 DCA為丙酮酸脫氫酶激酶抑制劑，由于抑制作用，使更多的丙酮酸進入線粒體，增加正常的線粒體氧化，抑制了糖酵解。線粒體的重構(gòu)會引起線粒體氧化磷酸化過程的損傷，可導(dǎo)致糖酵解代謝增高。其機制可能是線粒體中存在一些促細胞凋亡的介質(zhì)，當(dāng)線粒體轉(zhuǎn)運孔打開時，這些因子就會釋放到細胞質(zhì)中誘導(dǎo)凋亡。線粒體的去極化以及ROS的增加可能會造成線粒體的重構(gòu)，抑制MTP開放，使凋亡誘導(dǎo)因子不能釋放，最終導(dǎo)致對細胞凋亡的抵抗。線粒體還能調(diào)節(jié)一些重要的鉀離子、鈣離子等離子通道，如一些腫瘤細胞中的Kv通道因為線粒體的重構(gòu)而受到抑制，如果Kv通道被抑制，就可能造成細胞對凋亡的抵抗。已有研究表明，DCA可以降低線粒體膜電位，增加線粒體的過氧化氫，激活腫瘤細胞中的Kv通道，且不影響正常細胞，進一步介導(dǎo)細胞凋亡，抑制腫瘤生長。

徐靜等研究表明，DCA對缺氧復(fù)氧損傷引起的肥大心肌細胞的凋亡具有抑制作用。通過觀察心肌細胞凋亡形態(tài)學(xué)特征并檢測心肌細胞凋亡率，結(jié)果得出10-3mmol/L DCA在缺氧和復(fù)氧情況下相同時間內(nèi)的凋亡率較其他組及對照組顯著低，鑒于此理論基礎(chǔ)上我們把DCA添加到冷凍稀釋液中看是否對精子同樣具有抗凋亡作用。

3.3 結(jié)論 本試驗中凍后精子的畸形率和頂體完整率基本與徐靜等研究的結(jié)果相符，其具體的作用機制尚不清楚，需要進一步研究，但是從試驗結(jié)果整體來看，在冷凍稀釋液中添加DCA對凍后精子的畸形率和頂體完整率沒有改善作用。

[1] Polge C.Artificial insemination in pigs[J].Vet Rec，1956，68：62-76.

[2] 禚艷書.豬精液冷凍保存的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[3] 李剛，李青旺，張樹山，等.豬精液冷凍保存試驗效果初報[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2005，21（5）：70-75.

[4] 魏世寶，金一，苗婷婷.稀釋液中添加N-乙酰半胱氨酸對豬精液冷凍保存效果的影響[J].黑龍江動物繁殖，2007，15（2）：1-3.

[5] 江一平，卓丹心，陳勇，等.考馬斯亮藍染色法檢測人精子頂體反應(yīng)的評價[J].解剖學(xué)報，1998，29（3）：332-336.