液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定卷煙中的黃曲霉素

陳偉華

（河北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050051）

黃曲霉素（aflatoxin，AFT）是一類由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的真菌毒素，為二氫呋喃香豆素的衍生物，目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉素主要有B1、B2、G1、G2、M1、M2等幾種。其中，B1的毒性最強(qiáng)［1］，M1、M2主要存在于牛奶中［2－3］。人體攝入黃曲霉素后，通過破壞肝臟組織引起急、慢性中毒，長期攝入會誘發(fā)癌癥。近年來，AFB1污染事件的發(fā)生已引起世界各國對食品安全的關(guān)注［4－6］。美國、歐盟等國家對食品中黃曲霉素的含量進(jìn)行了嚴(yán)格限制，我國也已頒布食品和乳制品中黃曲霉素的檢測標(biāo)準(zhǔn)，并對其含量作了嚴(yán)格規(guī)定。

卷煙是一種以吸食為主要目的的快速消費(fèi)品，其質(zhì)量衛(wèi)生安全日益受到人們的重視。一直以來，不法分子為牟取暴利，以低等級和霉變煙葉作為原料，通過硫磺熏蒸［7］或使用其他非法添加物等手段，改善煙葉外觀，以假亂真，蒙蔽消費(fèi)者，嚴(yán)重?fù)p害了國家和消費(fèi)者的利益。另外，因儲存不當(dāng)，易致煙葉或卷煙發(fā)生霉變［8－10］。卷煙霉變后，不但燃燒性和吸味質(zhì)量顯著下降，而且對人體會造成潛在危害。目前，黃曲霉素的測定方法主要有薄層層析法（thin layer chromatography）［11］、免疫親和柱凈化液相色譜 法 （immune affinity column cleanse，HPLC）［12－13］、酶 聯(lián) 免 疫 法 （enzyme－linked immune sorbent assay）［14－15］、高 效 液 相 色 譜－串 聯(lián) 質(zhì) 譜 法（high performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry）［16］等，這些方法要么前處理繁瑣，要么不易單一定量或出現(xiàn)假陽性。HPLC法具有快速準(zhǔn)確、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，近年來得到快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，配合質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對大部分化合物的分離和準(zhǔn)確定量。目前，國外對煙草及其制品中的黃曲霉素的測定已有相關(guān)研究報(bào)道［17－19］，但在占世界卷煙消費(fèi)1／3的中國還未見報(bào)道。因此，準(zhǔn)確測定卷煙中的黃曲霉素，可對疑似霉變煙葉和卷煙的處理提供依據(jù)和參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 方法原理

樣品以三氯甲烷萃取，凈化并濃縮后，在選定的儀器參數(shù)下，進(jìn)行液相色譜－質(zhì)譜分析。采用對照標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和特征碎片離子定性，外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1200液相色譜儀；Agilent 6430三重四極桿質(zhì)譜儀，Paker NitroFlowLab氮?dú)獍l(fā)生器；Millipore Milli－Q 超純水制備系統(tǒng)；Binder FD53熱風(fēng)干燥箱；AG285型電子天平（感量0.000 1g）；KQ－700型超聲波清洗機(jī)；RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

黃曲霉素 M1、M2、G1、G2混標(biāo)（混合標(biāo)準(zhǔn)溶液）supelco；甲醇、異丙醇、三氯甲烷、正己烷，色譜純，dikma；乙酸銨，優(yōu)級純，國藥試劑；硅膠SPE柱，agilent，500mg／（5mL）；煙葉樣品取自倉庫，卷煙樣品購自市場。

1.3 樣品制備與凈化

按YC／T 31－1996要求制備試樣。稱取研磨好的試樣5.0g，置于50mL具塞錐形瓶中，加入20mL三氯甲烷，超聲提取30min。過濾，收集濾液于帶有刻度尾管的濃縮瓶內(nèi)，并用三氯甲烷洗滌濾渣，收集清洗液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上述濾液在50℃水浴中濃縮至約1mL，加入4mL正己烷混勻，注入活化好的硅膠SPE小柱中。依次用5mL正己烷、5mL三氯甲烷淋洗，棄去流出液。然后，用10mL三氯甲烷－甲醇溶液（體積比為9∶1）分2次洗脫，收集洗脫液于帶有刻度尾管的濃縮瓶內(nèi)。在氮?dú)獗Ｗo(hù)，50℃水浴條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將樣品濃縮至0.5mL。待液相色譜、質(zhì)譜分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用甲醇將黃曲霉素混標(biāo)稀釋為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度如表1所示。

表1 黃曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度 ng／mL

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

進(jìn)樣量：10μL；色譜柱：Zorbax SB－C18（2.1×50mm，1.8μm）；柱溫：45℃；流速：0.5mL／min；流動(dòng)相：A——10mmol／L 乙酸銨－水溶液，B——10mmol／L乙酸銨－甲醇溶液；梯度洗脫：0minw（B）＝5%、10minw（B）＝40%、15minw（B）＝100%、20minw（B）＝100%，后運(yùn)行5min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；干燥氣溫度：325℃；干燥氣流量：10L／min；霧化器壓力：344.75kPa（50psi）；毛細(xì)管電壓：4 000V；采集方式：MRM；三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），參數(shù)見表2。

表2 MRM采集參數(shù)表

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

以乙腈－水為流動(dòng)相時(shí)，乙腈抑制黃曲霉素化合物離子化導(dǎo)致質(zhì)譜信號降低，并且色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。以甲醇－水作為流動(dòng)相，質(zhì)譜信號提高，峰形對稱。實(shí)驗(yàn)在甲醇－水中添加乙酸銨提高質(zhì)譜靈敏度，當(dāng)流動(dòng)相中乙酸銨的濃度達(dá)到10mmol／L時(shí)質(zhì)譜信號最強(qiáng)。采用梯度洗脫條件，4種黃曲霉素在13min內(nèi)即達(dá)到較好的分離效果。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇－乙酸銨混合體系作為流動(dòng)相。標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖和實(shí)際樣品色譜圖見圖1和第31頁圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

圖2 實(shí)際樣品色譜圖

由于黃曲霉素化合物分子結(jié)構(gòu)中羰基具有強(qiáng)的電負(fù)性，有利于分子獲取氫離子，因此選擇正離子掃描較合理。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)考察了正、負(fù)離子掃描方式對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2靈敏度的影響。結(jié)果顯示，正離子掃描模式下質(zhì)譜信號明顯高于負(fù)離子掃描。然后，利用安捷倫自動(dòng)參數(shù)優(yōu)化軟件（mass hunter optimizer）可以自動(dòng)得到每個(gè)待測組分的最佳碰撞電壓和碰撞能，并確定最優(yōu)的子離子。

2.2 樣品提取和凈化

實(shí)驗(yàn)考察了超聲和振蕩2種方式對4種黃曲霉素的提取效果。在5.0g煙末樣品中加入1.0mL 4種黃曲霉素的混標(biāo)溶液，待溶液完全被樣品吸收后，再分別用乙酸銨水溶液、甲醇、異丙醇、三氯甲烷進(jìn)行超聲波，振蕩提取，測定4種待測物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸銨的提取效果不好；甲醇和異丙醇的提取液顏色較深，回收率在120%～200%；而用三氯甲烷提取時(shí)，樣品中4種待測物的干擾較小，回收率在70%～103%，故選三氯甲烷作為提取劑。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，確定用20mL三氯甲烷，超聲提取30min即可達(dá)到較好的效果。

煙草中含有幾千種化學(xué)成分，其提取物基質(zhì)較為復(fù)雜，且黃曲霉素的檢測在痕量范疇，因此，要通過合適的凈化方式去除干擾。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，常用的凈化方法有傳統(tǒng)固相萃取法、免疫親和固相萃取法以及多功能凈化柱法，這幾種方法均有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)固相萃取處理過程復(fù)雜，但回收率和精密度較好；免疫親和柱和多功能凈化柱處理過程相對簡單，但價(jià)格昂貴、不易保存、易失效，且回收率和精密度不如傳統(tǒng)固相萃取。因此，本實(shí)驗(yàn)選用SPE固相萃取柱凈化提取液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

對1.4中所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.5所述儀器條件進(jìn)行檢測，以質(zhì)量濃度X（ng／mL）對峰面積Y進(jìn)行線性回歸，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線；將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣10次，其3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢出限。結(jié)果如表3所示。

表3 4種黃曲霉素的線性方程與檢出限

2.4 精密度與回收率

按高、中、低3個(gè)加入水平，向不含黃曲霉素的空白試樣中加入黃曲霉素混標(biāo)，每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行6次平行測定，結(jié)果見第32頁表4。結(jié)果表明，采用本方法對空白樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，除黃曲霉G2的回收率較低為66.3%～70.7%，這可能是由于G2的測定重復(fù)性較差所致外，其他3種的平均回收率均在85.0%以上，且重復(fù)性小于10%。說明本方法比較可靠。

2.5 實(shí)際樣品檢測

用本方法對部分假冒卷煙或可疑霉變卷煙及煙葉樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果見第32頁表5。正常卷煙中未檢出黃曲霉素；部分可疑霉變煙葉中檢出B1，個(gè)別假冒卷煙中檢出G1，但含量均低于5μg／kg。

3 結(jié)論

采用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法對煙草中黃曲霉素的含量進(jìn)行了檢測，方法重復(fù)性較好，檢出限低，快速準(zhǔn)確，適合可疑霉變煙葉和卷煙中黃曲霉素的同時(shí)快速測定。

表4 精密度與加標(biāo)回收率

表5 部分假冒偽劣卷煙黃曲霉素的含量 μg／kg

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