免疫組化PV二步法與SP三步法比較

摘要：目的 比較免疫組化PV二步法和SP三步法。方法 通過兩組不一樣的試劑盒來對一樣的胃癌常規石蠟標本進行研究，比較免疫組化PV二步法和SP三步法在相同組織上的不同表達。結果 與二步法相比，三步法制片結果的陽性率和背景低，非特異性著色小，結果比較明確易讀；而與三步法相比較，二步法的操作更加簡單方便，檢查陽性率和陽性強度更高。結論 面對一抗為C-MET的免疫組化染色，三步法的實驗時間雖然更長，但是實驗結果明確易讀，對于科學研究比較適用。二步法則容易得出結果，陽性強度、靈敏度和假陽性率更高，容易出背景著色，對于科學研究不適用，但是因為二步法操作更加簡單方便，陽性檢出率更高，在診斷C-MET弱表達患者時漏診率低，得到結果的時間更短，所以適合用于臨床病理診斷。

關鍵詞：免疫組化；二步法；三步法

免疫組化技術就是通過已知的特異性抗體和抗原的特異性結合，來對細胞或者組織內某物質性質進行檢測，同時通過酶作用于底物所產生的顏色反應來對物質在細胞內的分布情況進行顯示[1]。隨著免疫酶標技術的發展，免疫組化技術也得到了快速的發展和完善，在臨床診斷和科研中免疫組化技術的應用也越來越廣泛。本研究選擇C-MET作為目的指標，對免疫組化二步法和三步法在C-MET檢測中的差異進行了觀察，分析了兩組方法在實際使用中的差異。

1資料與方法

1.1一般資料 選擇胃癌常規石蠟標本。選擇C-MET兔抗人多克隆抗體，胞漿著色表示陽性。二步法PV-9000試劑盒和三步法SP超敏試劑盒分別選購于兩個不同生產廠家。

1.2方法 選擇已知為陽性的乳腺癌組織作為陽性對照，選擇PBS替代一抗作為陰性對照。DAB顯色，嚴格按照相關的說明書來進行染色。三步法的具體操作如下：①對石蠟切片進行常規脫蠟直到水化，利用PBS對其進行3次沖洗，沖洗時間為3 min/次；②利用EDTA緩沖液進行浸泡，進行2 min的高壓修復，暴露抗體；③切片加入150 Ll過氧化酶阻斷溶液，在室溫下進行10 min孵育，從而來講內源性過氧化物酶活性阻斷。采用PBS進行3次沖洗，沖洗時間為3 min/次；④將PBS液去除，每張切片加正常非免疫動物血清150Ll，在室溫下進行10 min孵育；⑤將血清去除，每張切片加入第一抗體150 Ll；⑥采用PBS沖洗3次，沖洗時間為3 min/次，之后將PBS液去除，每張切片加入生物標記的第二抗體150 Ll，在室溫下進行10 min孵育，之后利用PBS沖洗3次，沖洗時間為3 min/次；⑦將PBS液除去，每張切片加入鏈霉菌抗生物素-過氧化酶溶液150 Ll，在室溫下進行10 min孵育，之后利用PBS沖洗3次，沖洗時間為3 min/次；⑧將PBS去除，每張切片加入新鮮配置的DAB600Ll，在顯微鏡下進行3～10 min的觀察；⑨采用自來水進行沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗反籃或者在沖洗之后利用PBS快速反藍；⑩采用梯度酒精進行脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠進行封固。

二步法和三步法相比，4～7的操作不同，二步法不采用正常血清進行封閉，直接加入第一抗體過夜，之后加入特異性二抗，其余操作步驟則和三步法相同。

1.3統計學方法 將數據納入SPSS 19.0統計軟件中進行分析，計數資料比較采用χ2比較，以率（%）表示，若（P<0.05）則差異顯著，有統計學意義。

2結果

與二步法相比，三步法制片結果的陽性率和背景低，非特異性著色小，結果比較明確易讀；而與三步法相比較，二步法的操作更加簡單方便，檢查陽性率和陽性強度更高。

3討論

二步法也被稱之為非生物素酶法，二步法中的第二抗體是將特異性抗體和辣根過氧化物酶利用多聚糖骨架連接成多聚體[2]。通過PV系列二步法免疫組化檢測試劑，在氨基酸骨架上將二抗抗體分子和酶聚合在一起，形成一種多聚體，從而來代替傳統方法中的三抗和二抗，讓抗原和抗體的結合信號得到有效放大，防止再次采用生物素，之后在利用DAB呈色反應來對抗原表達部位進行觀察。

三步法也被稱之為生物素酶法，實驗室采用的SP超敏試劑盒主要是利用鏈霉素抗生物蛋白-過氧化物酶鏈接系統來進行設計的。利用生物素對第二抗體進行標記；選擇從鏈霉菌中分離出的蛋白質作為鏈霉菌抗生物素蛋白，這種蛋白質的分子量為60KD，包含有亞基4個，每一個亞基都具有和生物素進行相連的部位，而且亞基和生物素之間的親和力比較強。鏈霉菌抗生物素蛋白和過氧化物酶形成鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復合體；生物素化的第二抗體和鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復合體，利用DAB呈色反應能將抗原抗體的結合部位有效顯示出來[3]。

本研究結果發現，與二步法相比，三步法制片結果的陽性率和背景低，非特異性著色小，結果比較明確易讀；而與三步法相比較，二步法的操作更加簡單方便，檢查陽性率和陽性強度更高。免疫組化三步法染色的非特異性著色率低于二步法，主要原因是三步法在加入一抗之前，采用血清封閉將內源性雜質去掉，從而對染色非特異性著色率產生了干擾，而PV二步法則沒有這一步驟，所以免疫組化三步法染色的非特異性著色率更低。二步法的靈敏度更高，第一抗體在4e環境下過夜背景更容易著色，所以三步法的假陽性率比二步法低，因此實驗室在對C-MET陽性率表達率進行研究檢測時，可以選擇采用三步法來有效防止誤差。但是三步法的時間更長，步驟較多，對操作人員也有比較高的要求，不容易檢測出陽性表達率不高的患者，而二步法則具有較高的靈敏度，漏診的幾率不大，沒有內源性生物素的影響，DAB顯色比較快，所以在臨床診斷時可以選擇二步法來進行，這樣能更快得出診斷結果。

本研究主要針對的是胃癌上一抗為C-MET時的結果，對于其他檢測指標，二步法和三步法是否也存在差異還需要進一步的分析和探討。

參考文獻：

[1]蓋文君，姚宏.免疫組織化學染色技術SP三步法與PV二步法比較探討[J].山西醫藥雜志，2013，05.

[2]朱淑玲，楊清緒，趙文麗.兩種免疫組織化學方法結果比較[J].中國醫藥指南，2010，08：29-30.

[3]張菁.肝組織HBsAg及HBcAg的三種免疫組化方法標記效果比較[J].臨床醫學，2010，10：5-6.

編輯/張燕