轉染微小RNA—132對骨肉瘤SaOS—2細胞生長和凋亡的作用

摘要：目的 觀察轉染微小RNA-132 （miR-132）對體外人骨肉瘤細胞株SaOS-2生長和凋亡的影響，并初步探討其作用機制。方法 實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測34例骨肉瘤組織及癌旁正常組織中miR-132 mRNA的表達；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）法檢測細胞增殖；細胞經DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡；Western blot檢測體外SaOS-2細胞中Mucin-4、HER-2和p-FAK蛋白的表達。結果 miR-132 mRNA在骨肉瘤組織中的表達明顯低于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P < 0.05）；與對照組相比較，轉染組細胞中miR-132 mRNA的表達明顯升高，細胞増殖被明顯抑制，凋亡細胞顯著增加，差異均有統計學意義（P <0.05）；Mucin-4、HER-2和p-FAK蛋白在轉染組細胞中的表達均下調，與對照組相比較，均有統計學差異（P<0.05）。結論 轉染miR-132對體外骨肉瘤細胞有增殖抑制和凋亡誘導作用，miR-132有望成為骨肉瘤治療的新靶點。

關鍵詞：骨肉瘤；miR-132；凋亡

Effects of MicroRNA-132 Transfection on the Proliferation and Apoptosis in Osteosarcoma SaOS-2 Cell Line in Vitro

ZHOU Qi

（The First People Hospital of Yueyang，Yueyang 414000， Hunan，China）

Abstract：Objective To observe the biological role and underlying mechanism of miR-132 in osteosarcoma proliferation and apoptosis. Methods The expression of miR-132 mRNA in the cancer tissue and their adjacent tissues in 34 osteosarcoma patients were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The biological effects of miR-132 transfection on osteosarcoma SaOS-2 cells were assessed by CCK-8 assay and DAPI staining. Western blotting was used to detect the expression of Mucin-4， HER-2 and p-FAK in SaOS-2 cells. Results The expression level of miR-132 mRNA was found to be downregulated in osteosarcoma tissues compared with the matched adjacent tissues. After transfection， the expression of miR-132 mRNA was significantly higher than control group. The proliferation of SaOS-2 cells was inhibited significantly by miR-132 transfection. Apoptosis rate induced by the miR-132 transfection was markedly higher than that of control. The proteins of Mucin-4， HER-2 and p-FAK were decreased after miR-132 transfection. Conclusion miR-132 is downregulated in osteosarcoma tissues， transfected of miR-132 can effectively inhibit proliferation and promote apoptosis of SaOS-2 cells in vitro， miR-132 may become a new target for the regulation of gene expression in osteosarcoma.

Key words：Osteosarcoma； miR-132； Apoptosis

1引言

骨肉瘤為最常見成骨性惡性腫瘤，多發于青少年，極易復發轉移，當前基因治療逐漸成為惡性腫瘤治療的前沿。微小RNA（microRNA， miRNAs）是一種內源性非編碼小分子RNA，在組織炎癥反應、細胞增殖與凋亡、組織分化以及惡性腫瘤發生和發展等多種生理過程中發揮著重要的作用[1]。其中miR-132是當前研究熱點之一，miR-132不僅在結腸癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤細胞中表達下調，同時與惡性腫瘤的轉移有著密切的關系[2， 3]，表明miR-132可能作為抑制惡性腫瘤的新作用靶點。為進一步明確miR-132調控惡性腫瘤生物學行為中的作用機制，本研究運用PCR技術觀察miR-132 mRNA在骨肉瘤組織和癌旁正常組織中的表達差異，并通過轉染miR-132至骨肉瘤細胞，檢測其對體外骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響，探討miR-132作為治療骨肉瘤新靶點的價值。

2資料與方法

2.1 一般資料 34例骨肉瘤組織標本取自2008年06月～2013年9月在我院骨外科行手術切除的骨肉瘤及對應的癌旁正常組織手術標本。其中男性11例，女性23例，年齡12～45歲，中位年齡23.6歲，所有病例均術后經病理檢查證實為骨肉瘤，術前均未行放化療，全部標本取材后迅速置于- 80℃冰箱保存備用。

2.2 主要試劑 胎牛血清、RPMI-1640培養基和含0.25%EDTA胰蛋白酶購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Mucin-4、HER-2、p-FAK、FAK和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；CyTM3標記miRNA-132 mimic購自銳博生物科技有限公司；SYBR實時熒光定量試劑盒、Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit、U6 snRNA real-time PCR Normalization Kit和脂質體LipfectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司。

2.3 細胞培養 人骨肉瘤細胞株SaOS-2購自ATCC，細胞培養在含l0%胎牛血清、質量濃度1×105 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養液中，置于37℃、5%的CO2的培養箱內培養，2～3 d換液1次，細胞單層貼壁生長至70%～80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

2.4 RT-qPCR檢測腫瘤組織中miRNA-132的表達 用Trizol試劑提取腫瘤組織及癌旁正常組織中的總RNA，按說明書操作。總RNA經紫外分光光度計測定260 nm與280 nm處光密度比值（D260/D280）為1.9～2.1，瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA純度。采用PrimeScript逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，采用SYBR實時熒光定量試劑盒進行實時定量PCR檢測，反應在25 μl體系中進行，反應條件：50 ℃下30 min逆轉錄，94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72℃延伸7 min。以U6 snRNA作為內參，miR-132的相對表達量采用2-△△Ct計算。

2.5 miR-132轉染及分組 將處于對數生長期的SaOS-2細胞按4×106個/孔接種到6孔板，每孔2 ml，細胞貼壁后分兩組：①對照組：在培養基中加入濃度為50 nmol/L的Lipofectamine 2000；②轉染組：在培養基中加入濃度為50 nmol/L 的CyTM3標記miRNA-132 mimic。培養24 h后收集細胞，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

2.6 RT-qPCR檢測miR-132轉染后miR-132的表達 轉染48 h后收集細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA并檢測RNA的完整性和純度，按照Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit說明書進行操作，以U6 snRNA作為內參，miR-132的相對表達量采用2-△△Ct計算。

2.7 CCK-8法檢測細胞增殖 將轉染后培養24 h的SaOS-2細胞，制成單細胞懸液，以每孔4×103個細胞接種到96孔板，每孔200 μl，細胞貼壁后放置培養箱分別培養24、48、72和96 h，每組設5個復孔，同時設置空白調零組（不加細胞，加入等量的PBS）。培養結束前1 h，各孔加入CCK-8溶液0.01 ml后繼續培養1 h，選擇酶標儀波長為490 nm，測量吸光度值（A490）。

細胞存活率 =（實驗組A490值-空白調零組A490值）/（對照組A490值-空白調零組A490值）×100%

2.8 熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡 將轉染后培養24 h的SaOS-2細胞調整細胞濃度為1×105/ml，取1 ml細胞懸液接種于普通載玻片上，放置于6孔板上，待細胞過夜貼壁后，經甲醛固定后再加DAPI溶液染色5 min，置于熒光顯微鏡下觀察。

2.9 Western blot檢測蛋白表達 收集轉染miR-132的SaOS-2細胞，裂解細胞并分離細胞蛋白質，用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品（20 μg/孔），常規8% SDS-PAGE電泳，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入特異性一抗（1：1000）于4 ℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為第二抗體（1：2500）室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶暴光強度用Quantity One 4.6.2（BIO， RAD）軟件分析，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

2.1數據的統計學分析 用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料均以均數±標準差（x±s）表示，正態分布變量兩組間比較用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

3結果

3.1 miR-132 mRNA在骨肉瘤組織和癌旁正常組織中表達 實時熒光定量PCR結果表明，在34例骨肉瘤及對應的癌旁正常組織手術標本中，miR-132 mRNA的相對表達量分別為0.25±0.04和0.84±0.19，有顯著性差異（P < 0.05）。

3.2各組SaOS-2細胞中miR-132 mRNA的表達 SaOS-2細胞經轉染CyTM3標記的miRNA-132 mimic后，miRNA-132 mRNA的相對表達量為4.27±0.58，與對照組（0.68±0.16）相比較，差異有統計學意義（P<0.05）。

3.3 CCK-8法檢測各組SaOS-2細胞增殖 如圖1所示，CCK-8結果表明，自48 h起，轉染組細胞存活率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），在第96 h，轉染組細胞存活率最低，為45.6%。

圖1 CCK-8法檢測轉染miR-132對SaOS-2細胞增殖的影響，

與對照組相比較，*P < 0.05。

3.4 流式細胞術檢測SaOS-2細胞凋亡 細胞經DAPI染色后，熒光顯微鏡下觀察到對照組SaOS-2細胞核完整，大小一致，而轉染組細胞核出現明顯固縮和凋亡小體等典型凋亡特征性改變（圖2）。

對照組 轉染組

圖2 熒光顯微鏡下觀察轉染miR-132后對SaOS-2細胞凋亡的影響（×400）。

3.5 轉染miR-132后對SaOS-2細胞中Mucin-4、HER-2和p-FAK蛋白表達的影響 如圖3所示，Western blot檢測結果表明，與對照組相比較，轉染組SaOS-2細胞中Mucin-4、HER-2和p-FAK蛋白的表達明顯下調，而FAK的表達無明顯影響，差異均有統計學意義（P < 0.05）。

圖3 Western blotting檢測轉染miR-132后對SaOS-2細胞中Mucin-4、

HER-2和p-FAK蛋白表達的影響，以β-actin為內參。

4討論

微小RNA（microRNAs， miRNAs）是一類非編碼小分子RNA，miRNAs可通過特異性識別靶基因mRNA的3’端非編碼區位點而抑制蛋白翻譯或誘導mRNA的降解，從而在轉錄后水平調控基因表達[1]。近年來研究表明miRNAs與惡性腫瘤的發生發展過程關系密切，其中miR-132 是目前比較公認的抑癌性miRNA，miR-132已經被發現在結腸癌和肺癌等多種惡性腫瘤中表達降低[2， 3]。miR-132主要是通過調控靶基因從而發揮抗腫瘤的作用，目前發現的幾十種miR-132靶基因中，大多數已經被證實可直接調控腫瘤惡性生物學行為，例如PDCD4基因可抑制細胞增殖，ZEB2基因可抑制細胞侵襲和轉移等[3， 4]。因此miRNAs有望成為惡性腫瘤診斷、治療及預后評估中新的分子靶點，但miR-132對骨肉瘤生長和凋亡的作用及其作用機制尚未見報道。為此，本研究比較了miR-132 mRNA在34例骨肉瘤組織及癌旁正常組織標本中的表達差異，結果表明miR-132 mRNA在骨肉瘤組織中的表達明顯降低，表明miR-132與骨肉瘤的發展過程關系密切。

癌癥的發生是多基因和多因素共同參與的細胞增殖、分化以及凋亡異常的過程，而腫瘤細胞凋亡異常與惡性腫瘤的關系最為密切，在既往研究中，miR-132被證實能抑制惡性腫瘤生長，并誘導細胞凋亡[5， 6]，但目前尚未有miR-132對骨肉瘤細胞作用的研究報道。為進一步研究miR-132在骨肉瘤細胞生物行為中的作用，本研究通過轉染miRNA-132至骨肉瘤SaOS-2細胞后，轉染組細胞中miRNA-132 mRNA的表達顯著上調，表明傳染細胞miRNA-132成功。為了分析轉染miRNA-132后對SaOS-2細胞增殖和凋亡的影響，CCK-8結果表明，轉染miRNA-132后對SaOS-2細胞增殖有抑制作用，同時在熒光顯微鏡下也觀察到轉染miR-132后對體外SaOS-2細胞有凋亡誘導作用，表明miR-132在骨肉瘤細胞生長和凋亡中的重要作用。

研究發現Mucins家族蛋白在惡性腫瘤的發生發展以及逃避機體免疫監視等多種病理生理過程中發揮了重要的作用，從而表明其在惡性腫瘤的診斷中具有一定價值[7， 8]。Mucin-4作為Mucins家族中的重要成員，Mucin-4在正常組織細胞中呈低表達或無表達，但在腫瘤組織細胞中呈高表達狀態[9]；同時Mucin-4與惡性腫瘤細胞對化療藥物耐藥性關系密切[10]；另外膜蛋白HER-2/ErbB-2作為與Mucin-4共存蛋白，HER-2蛋白在穩定Mucin-4蛋白中起到關鍵作用，而HER-2蛋白在多種惡性腫瘤中已經被證實與腫瘤發生和發展過程密切相關[11， 12]。在本研究中，SaOS-2細胞經轉染miRNA-132后，Mucin-4和HER-2蛋白的表達顯著下調，同時轉染miRNA-132后可有效抑制骨肉瘤細胞增殖，并誘導細胞凋亡，從而首次表明Mucin-4可能作為miRNA-132的靶蛋白，并在調控骨肉瘤細胞增殖和凋亡過程中發揮了一定的作用。另外，FAK作為HER-2的下游蛋白[13]，p-FAK與惡性腫瘤的發生發展、侵襲和轉移等行為密切相關[14]，在本研究中，轉染miRNA-132后可顯著抑制p-FAK的表達，從而與Mucin-4和HER-2的表達結果相一致。

綜上所述，本次實驗結果表明轉染miR-132后不僅可顯著抑制體外骨肉瘤SaOS-2細胞生長，還能有效誘導體外骨肉瘤細胞凋亡，其作用機制可能為miR-132通過調控Mucin-4等凋亡相關蛋白的表達有關，從而為臨床骨肉瘤基因治療提供一個新的作用靶點，但仍需進一步深入研究miR-132抗癌效應的具體機制。

參考文獻：

[1]Wu R，Li F，Zhu J，et al. A functional variant at？miR-132-3p， miR-212-3p， and miR-361-5p binding site in CD80 gene alters susceptibility to gastric？cancer？in a Chinese Han population[J]. Med Oncol，2014， 31（8）：60.

[2]Zheng YB，Luo HP，Shi Q，et al. miR-132？inhibits？colorectal？cancer invasion and metastasis via directly targeting ZEB2[J]. World J Gastroenterol，？2014， 20（21）：6515-6522.

[3]You J， Li Y， Fang N， et al. MiR-132 suppresses the migration and invasion of lung cancer cells via targeting the EMT regulator ZEB2[J]. PLoS One， 2014， 9（3）：e91827.

[4]You J， Li Y， Fang N， et al. MiR-132 suppresses the migration and invasion of lung cancer cells via targeting the EMT regulator ZEB2[J]. PLoS One， 2014， 9（3）：e91827.

[5]Wong HK， Veremeyko T， Patel N， et al. De-repression of FOXO3a death axis by microRNA-132 and -212 causes neuronal apoptosis in Alzheimer's disease[J]. Hum Mol Genet， 2013， 22（15）：3077-3092.

[6]Cheng AM， Byrom MW， Shelton J， et al. Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis[J]. Nucleic Acids Res， 2005， 33（4）：1290-1297.

[7]Dharmaraj N，Chapela PJ，Morgado M，et al. Expression of the transmembrane？mucins， MUC1， MUC4 and MUC16， in normal endometrium and in endometriosis[J]. Hum Reprod，2014， 29（8）：1730-1738.

[8]. Nakayama J. Dual Roles of Gastric Gland Mucin-specific O-glycans in Prevention of Gastric Cancer[J]. Acta Histochem Cytochem，2014， 47（1）：1-9.

[9]. Shibahara H，Higashi M，Koriyama C，et al. Pathobiological implications of mucin （MUC） expression in the outcome of small bowel？cancer[J]. PLoS One，2014， 9（4）：e86111.

[10]. Workman HC， Sweeney C， Carraway KL . The membrane mucin Muc4 inhibits apoptosis induced by multiple insults via ErbB2-dependent and ErbB2-independent mechanisms[J]. Cancer Res， 2009， 69（7）：2845-2852.

[11]. Kaur S，Sharma N，Krishn SR，et al. MUC4-mediated regulation of acute phase protein lipocalin 2 through？HER2/AKT/NF-κB signaling in pancreatic cancer[J]. Clin Cancer Res，2014， 20（3）：688-700.

[12]. Chaturvedi P， Singh AP， Chakraborty S， et al. MUC4 mucin interacts with and stabilizes the HER2 oncoprotein in human pancreatic cancer cells[J]. Cancer Res， 2008， 68（7）：2065-2070.

[13]. Luo CW，Wu CC，Ch'ang HJ. Radiation sensitization of tumor cells induced by shear stress： The roles of integrins andFAK[J]. Biochim Biophys Acta，？2014， 1843（9）：2129-2137.

[14]. Owens LV， Xu L， Dent GA， et al. Focal adhesion kinase as a marker of invasive potential in differentiated human thyroid cancer[J]. Ann Surg Oncol， 1996， 3（1）：100-105.

編輯/馮焱