林木腐爛病主要致病菌Cytospora sacculus致病力分化的初步研究

摘要： 為了明確不同寄主來源的新疆林木腐爛病主要致病菌Cytospora sacculus致病力分化情況。采用不同寄主枝條接種法篩選出代表菌株；采用二硝基水楊酸法、菌絲生長速率法和高效液相色譜法測定果膠酶活性、菌絲生長速率和毒素。結(jié)果表明，不同寄主來源的C. sacculus菌株存在明顯的致病性差異，其對原分離寄主枝條的致病力最強，對其他樹種枝條的致病力較弱。果膠酶活性、菌絲生長速率以及毒素產(chǎn)生種類及數(shù)量是造成不同寄主來源菌株致病力差異的主要原因。

關(guān)鍵詞： 新疆； 林木腐爛病； 蘋果樹腐爛病菌； 致病力分化

中圖分類號：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）03-0638-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.023

Abstract： In order to clarify Cytospora sacculus that the main pathomycete of woods canker in Xinjiang differentiation of pathogenicity and the mechanism of differentiation. A total of 22 C.sacculus strains come from 6 hosts were cross inoculated on 4 tree branches. Five typical strains were selected and its pectinase activity， mycelial growth rates and toxins were analyzed by dinitrosalicylic acid （DNS）， plate method and high performance liquid chromatography （HPLC） methods. The results showed that different host sources of C.sacculus existed obvious pathogenic differentiation， and the pathogenicity of typical strain were strongest to primary come from host， but were weak to other species of tree branches. The pectinase activity， mycelial growth rates and toxins production difference were main reason for the differentiation in pathogenicity.

Key words： Xinjiang； valsa canker of tree； Cytospora sacculus； differentiation of pathogenicity

殼囊孢屬（Cytospora）真菌有550個種[1]，其中約500個種可引起60多屬闊葉和針葉林木腐爛病，其有性型分屬于子囊菌門肉座菌目Valsa、Leucostoma、Vailsella和Valseutypella 4個屬[2]。在自然條件下腐爛病菌難以形成有性階段，因此往往依據(jù)寄主來描述其種類，然而不同寄主和環(huán)境條件對子座和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)影響較大，使得以形態(tài)特征鑒定腐爛病菌非常困難，因此ITS序列分析目前也已用殼囊孢屬真菌的種類鑒定[3]。在2010～2012年，筆者分別從新疆的梨、蘋果、紅棗、楊、柳和國槐6種樹上分離到腐爛病菌141株，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和ITS序列分析，將其中的123株鑒定為C. sacculus（有性型Valsa mali，曾用名V. ceratersperma （Tode：Fr.） Maire），占分離菌數(shù)量的87.2%，這些不同寄主來源的C. sacculus能否在不同寄主間相互侵染以及致病力有無差異尚不清楚。已有文獻(xiàn)報道蘋果樹腐爛病菌V. mali不同來源菌株具有非常復(fù)雜的遺傳分化情況[4]，且不同寄主來源的菌株存在表型和致病性差異[5]。腐爛病菌產(chǎn)生的果膠酶、纖維素酶等細(xì)胞壁降解酶和羥基苯甲酸、原兒茶酸、間苯三酚、對羥基苯丙酸和對羥基苯乙酮等毒素對病菌的致病力分化起關(guān)鍵作用[6-8]。目前腐爛病是新疆經(jīng)濟林、生態(tài)林和景觀林上發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的病害之一，然而對不同寄主之間的腐爛病菌有無關(guān)聯(lián)、相互間能否侵染以及菌株間有無致病力分化等問題深入研究的較少，制約了新疆林木腐爛病的防治。本試驗選取從新疆梨、蘋果、紅棗、楊、柳和國槐樹上分離鑒定的C.sacculus為對象，研究其在不同寄主上的致病力差異情況以及產(chǎn)生致病力差異的機理，為確定新疆林木腐爛病發(fā)生規(guī)律及有效防治措施提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 從新疆梨、蘋果、紅棗、楊、柳和國槐樹上采集、分離和鑒定保存的C. sacculus菌株22株。菌株編號和來源見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）[4]：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、去離子水1 000 mL，pH6.8；②馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基[4]：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、去離子水1 000 mL，pH 6.8；③酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基[4]：酵母浸粉5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g；④除去果膠的樹皮培養(yǎng)基[8]：刮取幼嫩的蘋果樹、楊樹、柳樹和榆樹樹皮，分別稱取4種樹皮各10 g，加適量去離子水100 ℃水浴加熱10 min，過濾除去含果膠的殘渣，在濾液中加入15 g瓊脂，去離子水定量到1 000 mL，制成4種除去果膠的樹皮培養(yǎng)基；⑤根皮苷培養(yǎng)基[9]：根皮苷4 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，去離子水1 000 mL；⑥果膠培養(yǎng)基，參考何媛媛等[10]的方法并略作調(diào)整：KNO3 2.00 g、KCl 0.50 g、FeSO4 0.01 g、K2HPO4 1.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、去離子水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min冷卻后在無菌條件下加入85 ℃下滅菌1 h的蘋果果膠干粉10 g、100 ppm卡納霉素1 mL。

1.1.3 供試枝條 在石河子市內(nèi)采集健康、長勢一致的1～2年生蘋果樹、楊樹、柳樹和榆樹枝條，截成20 cm小段，將枝條用自來水沖洗干凈后用10% HClO浸泡10 min，然后用去離子水沖洗干凈、風(fēng)干，枝條頂端用保鮮膜包裹備用。

1.2 方法

1.2.1 代表菌株篩選

1）不同菌株培養(yǎng)特征觀察 將各菌株在PDA平板上活化后，接種在PDA平板中央，28 ℃暗培養(yǎng)。5 d后觀察其表型特征，記錄其菌落色澤、菌絲狀況等。

2）不同菌株在4種寄主上致病力測定 采用離體枝條接種法[11]進(jìn)行致病性測定。將準(zhǔn)備好的蘋果樹、楊樹、柳樹和榆樹樹枝表皮燙傷，從培養(yǎng)4 d的各菌株菌落邊緣打取菌餅，以帶菌絲的一面緊貼在燙傷部位，并用保鮮膜包裹，對照接種無菌的PDA塊。在枝條下端裹一塊去離子水浸濕的脫脂棉團(tuán)，并將其放入有濾紙保濕的托盤內(nèi)，在25 ℃下培養(yǎng)。每個菌株3次重復(fù)，每個重復(fù)接種10個枝條，10 d后觀察記錄枝條發(fā)病情況。根據(jù)菌落形態(tài)和在不同寄主枝條上的病斑大小選出代表菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 果膠酶酶活測定 取篩選出的5個代表菌株進(jìn)行果膠酶酶活測定[10]。將培養(yǎng)4 d的PDA菌塊移入果膠培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)7 d， 真空抽濾去除菌絲和孢子，4 ℃下10 000 r/min離心15 min，棄去沉淀，留上清即為粗酶液。取1 mL粗酶液于試管中，在50 ℃水浴中平衡5 min，加入預(yù)平衡至50 ℃的果膠底物0.5 mL，50 ℃保溫30 min，加入3.0 mL DNS終止反應(yīng)后，沸水浴5 min，用流動水冷卻至室溫，最后加去離子水定容到10 mL，測定A540 nm，以煮沸10 min滅活粗酶液為對照。根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算D-半乳糖醛酸含量。酶活力單位（U）：50 ℃、pH 3.8的條件下，每小時每毫克酶蛋白催化底物釋放1 mg還原糖。蛋白質(zhì)含量測定按Bradford方法，用考馬斯亮藍(lán)G-250顯色，在595 nm下比色測定，用牛血清作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 菌絲生長速度測定 從培養(yǎng)4 d的5個代表菌株菌落邊緣打取菌餅，分別接種到4種樹皮培養(yǎng)基中央，28 ℃暗培養(yǎng)。每個重復(fù)3次，每24 h測量菌落直徑。菌絲生長速度為單位時間內(nèi)的平均菌落直徑[12]。

1.2.4 產(chǎn)毒素能力測定 5株代表菌株毒素測定參照王建華等[9]的方法。在根皮苷培養(yǎng)基中分別接入6塊各代表菌株的菌餅，在28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)10 d，分別取樣100 mL過0.45 μm濾膜，毒素提取方法參考Wang等[8]的方法，取離心后的上清液用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加入等體積乙酸乙酯萃取3次，將有機相合并后置于60 ℃下減壓濃縮。待乙酸乙酯蒸干后用甲醇溶解蒸餾物，定容至50 mL，樣品經(jīng)0.22 μm的有機相濾膜過濾后供HPLC測定分析。每試驗設(shè)置3次重復(fù)。以間苯三酚、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯丙酸和對羥基苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)品作為外標(biāo)物。檢測條件為：RP-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測波長260 nm，流動相甲醇-水溶液（1∶1，v/v），流速0.5 mL/min，柱溫28 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株培養(yǎng)特征

22個供試菌株在PDA平板上呈現(xiàn)出3種菌落形態(tài)。其中從柳樹上采集的6T4L-L代表菌株菌落邊緣羽毛狀，可產(chǎn)生大量灰黑色氣生菌絲，菌落初期為白色，后期灰黑色，培養(yǎng)10 d左右可產(chǎn)生大量子實體，僅6T4L-L菌株表現(xiàn)該形態(tài)（圖1A、圖1D）；采集自蘋果樹上的6T4L-P4菌株菌落初為白色，后期中央乳白色，外圍白色，呈放射狀，10 d后可產(chǎn)生少量子實體，有20個菌株表現(xiàn)該菌落形態(tài)（圖1B、圖1E）；采集自梨樹上的9-1菌株在5 d左右菌落背面中心變?yōu)辄S褐色，邊緣黃綠色，10 d后菌落整體為黃褐色，氣生菌絲少，未發(fā)現(xiàn)子實體，僅9-1菌株表現(xiàn)該形態(tài)（圖1C、圖1F）。

2.2 致病力測定結(jié)果

22個菌株對蘋果樹、楊樹、柳樹和榆樹的致病力測定結(jié)果見表2。由表2可知，22個菌株均可使蘋果樹、楊樹、柳樹和榆樹發(fā)病，但對4種樹木枝條的致病力存在顯著差異。其中分離于巴州庫爾勒市香梨樹上的9-1菌株對蘋果樹和楊樹枝條的致病力最強，病斑大小分別為2.41 cm2和2.01 cm2，在榆樹和柳樹枝條上的病斑僅為0.76 cm2和0.44 cm2；而6T4L-P4菌株在蘋果樹枝條上的病斑為3.98 cm2，其次是楊樹上的病斑為1.67 cm2，在榆樹和柳樹上的病斑僅為0.94 cm2和0.92 cm2；分離于6團(tuán)柳樹上的6T4L-L菌株在柳樹枝條上的病斑為1.89 cm2，其次是榆樹的病斑為1.55 cm2，在楊樹和蘋果樹枝條上的病斑僅為0.74 cm2和0.48 cm2；分離于巴州28團(tuán)香梨樹上的28-1-7-DS在楊樹和柳樹上的病斑分別為1.33 cm2和1.37 cm2，在蘋果樹和榆樹上分別為1.04 cm2和0.72 cm2；采自于巴州和碩縣國槐樹上的HS-GH-3菌株對柳樹和榆樹的致病力最強，病斑達(dá)到1.58 cm2和1.15 cm2，在楊樹和蘋果枝條上的病斑分別為0.79 cm2和0.62 cm2。依據(jù)菌落培養(yǎng)特征、寄主和各菌株在不同樹木枝條上表現(xiàn)出的致病力差異篩選出9-1、6T4L-L、6T4L-P4、28-1-7-DS和HG-GH-3這5個菌株用于后續(xù)研究。

2.3 果膠酶活性及菌絲生長速率

5個代表菌株的果膠酶活性均存在顯著差異（表3）。其中果膠酶活性最高的是9-1菌株，其酶活性為30.82 U/mg，其次為6T4L-P4菌株，果膠酶活性為26.99 U/mg；28-1-7-DS和HS-GH-3菌株的果膠酶活性分別為11.97 U/mg和10.93 U/mg，而6T4L-L菌株的活性最低，僅為7.89 U/mg。

在除去果膠的樹皮培養(yǎng)基上，5個代表菌株均能生長，但不同菌株菌絲在不同樹皮培養(yǎng)基上生長速度存在顯著差異（表4）。其中在蘋果樹皮培養(yǎng)基上，采自巴州庫爾勒香梨上的9-1菌株菌絲生長速度最快，達(dá)到16.92 mm/d，而采自阿克蘇6團(tuán)柳樹上的6T4L-L菌株的菌絲生長速度僅為5.50 mm/d；在除去果膠的楊樹樹皮培養(yǎng)基上，9-1菌株菌絲生長速度最快，達(dá)到15.5 mm/d，而采自阿克蘇6團(tuán)柳樹上的6T4L-L菌株的菌絲生長速度僅為9.08 mm/d。在除去果膠的柳樹樹皮培養(yǎng)基上，采自國槐上的HS-GH-3菌株和采自蘋果樹上的6T4L-P4的生長速率最快，分別達(dá)到18.67 mm/d和18.08 mm/d，而6T4L-L和28-1-7-DS的菌絲生長速率僅為14.45 mm/d和12.05 mm/d；在除去果膠的榆樹樹皮培養(yǎng)基上，6T4L-P4菌株和HS-GH-3菌株的菌絲生長速率最快，分別為18.17 mm/d和17.05 mm/d，而6T4L-L和28-1-7-DS的菌絲生長速率僅為11.73 mm/d和8.5 mm/d。通過對5個代表菌株的果膠酶活性和在去除了果膠的樹皮培養(yǎng)基的菌絲生長速率進(jìn)行分析，可以確定不同菌株的果膠酶活性存在明顯差異，但不是決定菌株致病力差異的主要因素，不同樹皮中還存在一些物質(zhì)可以影響病原菌菌絲的生長。

2.4 毒素種類及數(shù)量

5個代表菌株中，分離自梨樹上的9-1菌株和蘋果樹上的6T4L-P4菌株可以代謝根皮苷生長，而在6T4L-L、HS-GH-3和28-1-7-DS的根皮苷培養(yǎng)基中未檢測到根皮苷降解產(chǎn)物（表5）。其中9-1菌株培養(yǎng)液中檢測到間苯三酚、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯丙酸和對羥基苯乙酮5種毒素，其含量分別為56.66、5.36、2.71、21.88、10.08 mg/L；6T4L-P4菌株培養(yǎng)液中檢測到間苯三酚、原兒茶酸、對羥基苯甲酸和對羥基苯乙酮4種毒素，其含量分別為39.83、2.34、1.86、9.68 mg/L。

3 小結(jié)與討論

蘋果樹腐爛病菌Valsa mali（無性型C. sacculus）存在明顯的致病性分化情況[4，7，8]，本研究挑選了分離自新疆梨樹、蘋果樹、棗樹、楊樹、柳樹和國槐樹上的C. sacculus菌株22株，將其分別接種于蘋果樹、楊樹、柳樹和榆樹枝條上，22株菌均能導(dǎo)致接種枝條發(fā)病，但在不同枝條上致病力存在很大差異。其中分離于梨樹上的9-1菌株對蘋果樹和楊樹的致病力最強，對榆樹和柳樹枝條致病力較弱；分離于蘋果樹上的6T4L-P4菌株對蘋果樹枝條致病力最強，對楊樹、榆樹和柳樹致病力較弱；分離于柳樹上的6T4L-L菌株在柳樹枝條致病力最強，對榆樹、楊樹和蘋果樹枝條致病力較弱；分離于梨樹上的28-1-7-DS對楊樹和柳樹致病力最強，而對蘋果樹和榆樹枝條致病力較弱；分離于國槐樹上的HS-GH-3菌株對柳樹和榆樹的致病力最強，對楊樹和蘋果樹枝條的致病力較弱。

蘋果樹腐爛病菌為弱寄生菌，主要通過產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶和毒素類物質(zhì)，分解或殺死寄主細(xì)胞而進(jìn)行侵染[13，14]。本研究對5個代表菌株的果膠酶活性測定表明，9-1和6T4L-P4菌株果膠酶活性最高，分別為30.82、26.99 U/mg，而6T4L-L、HS-GH-3和28-1-7-DS 3個菌株的果膠酶活性較低。在去除了果膠影響的4種樹皮培養(yǎng)基上，不同菌株的菌絲生長速度存在顯著差異，說明盡管果膠酶活性可以影響腐爛病菌的致病力，但不是決定性因子，在不同樹種的樹皮中存在影響菌絲生長速率的因子。已有文獻(xiàn)表明，蘋果樹皮中富含根皮苷，腐爛病菌能夠利用蘋果樹皮中的根皮苷將其轉(zhuǎn)化為間苯三酚、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯丙酸和對羥基苯乙酮等毒素，這些毒素會進(jìn)一步加重腐爛病的發(fā)生[8，9]。本研究所選取的5個代表菌株在根皮苷培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中9-1和6T4L-P4菌株可以代謝根皮苷生長，9-1菌株產(chǎn)生了5種毒素，6T4L-P4菌株產(chǎn)生了4種毒素，且兩菌株產(chǎn)毒素量存在顯著差異，而在6T4L-L、HS-GH-3和28-1-7-DS的根皮苷培養(yǎng)基中未檢測到根皮苷降解產(chǎn)物。

新疆因冬季寒冷，各種林木易受凍害，林木受凍后次年易發(fā)生腐爛病導(dǎo)致大量林木死亡。本研究通過對采集和分離自新疆不同地區(qū)和不同林木上的腐爛病菌C. sacculus對蘋果樹、楊樹、柳樹和榆樹4種林木枝條做致病性測定，證明其可在各種林木上交叉侵染，但在不同樹種上存在致病力差異。導(dǎo)致致病力差異的因素除了其果膠酶活性有差別外，關(guān)鍵是不同樹種的樹皮中的營養(yǎng)物質(zhì)成分有差異，可以影響腐爛病菌的菌絲生長速率，有些菌株還可以利用樹皮中的成分產(chǎn)生毒素，進(jìn)一步加重了腐爛病的嚴(yán)重程度。因此新疆的經(jīng)濟林、生態(tài)林和綠化林木腐爛病菌可以相互侵染，人們在對果園腐爛病進(jìn)行防治的同時，還應(yīng)當(dāng)注重果園周邊綠化林的腐爛病防治，以減少病原菌初侵染源，減輕腐爛病的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)：

[1] ADAMS G C，SURVE-IYER R S，IEZZONI A F. Ribsomal DNA sequence divergence and group I introns with in the Leucostoma species L. cinctum，L. persoonii，and L. parapersoonii sp. nov.，ascomycetes that cause Cytospora canker of fruit trees[J].Mycologia，2002，94（6）：947-967.

[2] FOTOUHIFAR K B，HEDJAROUDE G A，LEUCHTMANN A. ITS rDNA phylogeny of Iranian strains of Cytospora and associated teleomorphs[J].Mycologia，2010，102（6）：1369-1382.

[3] 王旭麗，康振生，黃麗麗，等. ITS序列結(jié)合培養(yǎng)特征鑒定梨樹腐爛病菌[J].菌物學(xué)報，2007，26（4）：517-527.

[4] 臧 睿，黃麗麗，康振生，等.陜西蘋果樹腐爛病菌（Cytospora spp.）不同分離株的生物學(xué)特性與致病性研究[J].植物病理學(xué)報，2007，37（4）：343-351.

[5] SUZAKI K. Population structure of Valsa ceratosperma，causal fungus of Valsa canker，in apple and pear orchards[J]. Plant Pathology，2008，74（2）：128-132.

[6] WANG X L，WEI J L，HUANG L L，et al. Re-evaluation of pathogens causing Valsa canker on apple in China[J]. Mycologia，2011，103（2）：317-324.

[7] 周玉霞，張美鑫，翟立峰，等.梨和蘋果腐爛病菌不同培養(yǎng)表型菌株的致病性分析[J].植物病理學(xué)報，2014，44（2）：217-220.

[8] WANG C X，LI C，LI B H，et al. Toxins produced by Valsa mali var. mali and their relationship with pathogenicity[J]. Toxins，2014，6（3）：1139-1154.

[9] 王建華，柯希望，黃以超，等.蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液中根皮苷主要降解成分的分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，40（8）：89-94，105.

[10] 何媛媛，于 哲，王海英，等.不同碳氮源對蘋果樹腐爛病菌胞外果膠酶活性的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，42（11）：81-86.

[11] 韋潔玲，黃麗麗，郜佐鵬，等.蘋果樹腐爛病室內(nèi)快速評價方法的研究[J].植物病理學(xué)報，2010，40（1）：14-20.

[12] 臺蓮梅，趙巧蘭，靳學(xué)慧，等.馬鈴薯立枯絲核菌生物學(xué)特性研究[J].植物保護(hù)，2015，41（1）：89-92.

[13] 雍道敬，李保華，王彩霞.蘋果樹腐爛病菌不同致病力菌株對蘋果的誘導(dǎo)效應(yīng)[J].植物生理學(xué)報，2014，50（6）：810-816.

[14] 陳曉林，牛程旺，李保華，等.蘋果樹腐爛病菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的種類及其活性分析[J].華北農(nóng)學(xué)報，2012，27（2）：207-212.