IPTG誘導劑對C型產氣莢膜梭菌β2毒素基因表達的影響

摘要：對已構建的含β2毒素基因重組質粒pETXB2進行限制性核酸內切酶酶切鑒定，并用SDS-PAGE檢測不同培養條件下β2毒素基因的表達情況。經酶切鑒定證實，pETXB2重組質粒含有β2毒素基因而且閱讀框架和基因序列正確。同時采用IPTG誘導劑在改變培養基的pH、培養溫度、誘導劑的加入量及誘導時間4個方面對β2毒素基因表達進行調控，其最佳的表達條件是37 ℃，pH 7.0的培養基中，用終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導4 h，β2毒素蛋白的表達效果最好。

關鍵詞：C型產氣莢膜梭菌；β2毒素基因；優化表達

中圖分類號：S852；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）03-0749-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.051

Abstract： An identification of recombinant plasmid pETXB2 containing β2-toxin gene was conducted with restriction endonuclease enzyme digestion， and the expression levels of β2-toxin gene under different cultural conditions were detected. By enzyme digestion identification， the recombinant plasmid pETXB2 contained β2-toxin gene and have positive reading frame. Meanwhile IPTG was adopted as inducer to regulate and control expression of the β2-toxin gene in four aspects of changing medium pH， culture temperature， amount of inducer， and inducing time. Results showed that， the optimal condition was the temperature 18 ℃， medium pH 7.0， final concentration 0.8 mmol/L IPTG， inducing time 4 hours， the expression effect of β2-toxin protein was optimized under the condition.

Key words：Clostridium perfringene type C； β2-toxin gene； optimal expression

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens） 是人類和動物主要的病原體，可引起腸道和組織感染，是多種腸毒血癥、腸炎、食物中毒和氣性壞疽的主要病原菌之一[1-4]。產氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性梭狀芽孢桿菌，可產生至少17種毒素，其中主要毒素為α毒素、β毒素、ε毒素和ι毒素，根據產生的毒素類型將其分為A、B、C、D和E 5種毒素型[5-8]。作為一種重要的病原體，產氣莢膜梭菌廣泛分布于水和食物等各種環境，此外在人和多種動物的腸道菌群中也普遍存在。產氣莢膜梭菌以芽孢和繁殖體形式棲居在土壤里，由于其能產生具有抵抗力的芽孢，已成為水污染重要的指示菌[9-11]。

產氣莢膜梭菌所有的菌型均產生α毒素，B型和C型主要產生β毒素，B型和D型主要產生ε毒素，E型主要產生ι毒素[12]。研究人員一直認為C型產氣莢膜梭菌產生的β毒素只有一種，但新近研究表明其可產生β1和β2兩種毒素，其中β2毒素是更重要的毒力因子，β2毒素與β1毒素及其他毒素均沒有顯著的氨基酸序列同源性，但與β1毒素具有相似的生物學活性，對于腸細胞都具有細胞毒性并且小劑量毒素即可導致小鼠死亡[13-15]。目前，鮮見國內關于β2毒素基因克隆與表達調控的報道，本試驗克隆了β2毒素基因并明確了其核苷酸序列，同時以IPTG為誘導劑和改變培養條件對β2毒素基因表達進行調控，實現目的蛋白表達的最大化，從而為下一步大規模工業化生產β2毒素基因工程亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株和質粒

C型產氣莢膜梭菌強毒菌C59-44購自中國獸藥監察所；受體菌JM109、BL21（DE3）、載體pET- 28c由吉林化工學院分子生物學實驗室保存；質粒pGEM-T購自Promega公司。

1.2 試劑

質粒提取試劑盒、Wizard PCR preps DNA Puri fication System、IPTG和TEMED購自Promega公司；限制性核酸內切酶（NcoⅠ、BamHⅠ）購自Sigama公司；β-巰基乙醇、溶菌酶購自北京天根生物技術有限公司；卡那霉素（Kanamycin）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；過硫酸胺、N-N′-甲叉丙烯酰胺、丙烯酰胺購自華美生物公司；β2毒素抗血清購自中國獸藥監察所。

1.3 β2毒素基因的擴增

以提取的C型產氣莢膜梭菌中國標準株C59-44基因組DNA為模板，根據Gibert[16]報道的β2毒素基因核苷酸序列，設計合成一對引物（P1、P2）并分別引入NcoⅠ和BamHⅠ酶切位點。P1：5′-CATGCCATGGCAAAAGAAATCGACGCTTAT-3′，P2：5′- CGCGGATCCTGCACAATACCCTTCACCAAA-3′（下畫線表示酶切位點）。按總體積25 μL反應體系進行PCR擴增，其中模板DNA 5 ng，Primer 0.1 μmol/L，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 200 μmol/L，MgCl2 2.5 μL，Taq DNA酶 2.5 U。程序：95 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 60 s， 47 ℃退火 60 s，72 ℃延伸 2 min，共30個循環；72 ℃再延伸10 min；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.4 重組質粒pETXB2的構建及酶切鑒定

利用Wizard PCR preps DNA Purification System回收擴增的β2毒素基因片段，產物經Nco I/BamHⅠ酶切后與經同樣酶切處理的表達載體pET-28c連接，構建表達重組體pETXB2。反應體系：pET-28c Vector 1 μL，10×T4 DNA酶 buffer 5 μL，T4 DNA酶 1.5 μL，PCR Product 2 μL，ddH2O 0.5 μL，14 ℃過夜。將連接反應產物以CaCl2法轉化至感受態細胞BL21（DE3）中，取200 L菌液涂布于含卡那霉素LB瓊脂平板上，37 ℃過夜培養，挑取陽性菌落。采用堿裂解法提取質粒，并用聚乙二醇（PEG8000）法純化質粒DNA，采用Nco Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切進行鑒定。

1.5 表達產物SDS-PAGE分析和ELISA檢測

按文獻[17]介紹的方法進行。

1.6 IPTG對β2毒素基因的表達調控

1.6.1 確定β2表達最適pH 分別將LB液體培養基的pH調為6.5、7.0和7.5，每瓶10 mL分裝于3個50 mL錐形瓶中滅菌，每瓶加30 μL 50 mg/mL的卡那霉素，然后接種1%的重組菌株BL21（DE3）（pETXB2），37 ℃ 160 r/min搖床振蕩培養，達到對數生長期時加入IPTG至終濃度0.8 mmol/L，繼續振蕩培養4 h，離心收集菌體，SDS-PAGE分析表達產物。

1.6.2 確定β2表達最適溫度 將40 mL pH 7.0的LB液體培養基平均分裝于4個50 mL三角燒瓶中滅菌，并分別加入30 μL 50 mg/mL的卡那霉素，然后接種1%的重組菌株BL21（DE3）（pETXB2），分別于35、36、37、38 ℃ 160 r/min搖床振蕩培養，達到對數生長期時加入IPTG至終濃度0.8 mmol/L，繼續振蕩培養4 h，離心收集菌體，SDS-PAGE分析表達產物。

1.6.3 確定β2表達最適IPTG誘導濃度 將40 mL pH 7.0的LB液體培養基平均分裝于4個50 mL三角燒瓶中滅菌，并分別加入30 μL 50 mg/mL的卡那霉素，然后接種1%的重組菌株BL21（DE3）（pETXB2）， 160 r/min，37 ℃恒溫培養至對數生長期，燒瓶中分別加入IPTG，調其濃度最終至0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L后，繼續培養4 h，SDS-PAGE檢測表達產物。

1.6.4 確定β2表達最適誘導時間 將40 mL pH 7.0的LB液體培養基平均分裝于4個50 mL三角燒瓶中滅菌，并分別加入30 μL 50 mg/mL的卡那霉素，然后接種1%的重組菌株BL21（DE3）（pETXB2），160 r/min，37 ℃恒溫培養至對數生長期，燒瓶中分別加入IPTG并調其濃度最終至0.8 mmol/L，分別培養1、2、3、4和5 h后，采用SDS-PAGE檢測表達產物。

2 結果與分析

2.1 β2毒素基因的擴增及pETXB2表達質粒的構建

利用PCR技術，以產氣莢膜梭菌中國標準株（C59-44）基因組DNA為模板，擴增了0.72 kb β2毒素基因并連接到表達載體pET-28c，構建了重組菌株BL21（DE3）（pETXB2），提取pETXB2質粒，NcoⅠ/BamH Ⅰ酶切鑒定證實其含有β2毒素基因片段，基因測序表明其閱讀框架正確（圖1），其結構如圖2所示。

2.2 β2毒素蛋白的SDS-PAGE分析

將構建的重組菌株BL21（DE3）（pETXB2）在37 ℃下培養，0.8 mmol/L IPTG誘導4 h后進行SDS-PAGE分析（圖3），凝膠成像分析結果表明，β2毒素蛋白的表達量占菌體總蛋白含量的31%。

2.3 β2毒素蛋白ELISA檢測

超聲波裂解BL21（DE3）（pETXB2）菌體，對裂解物及陽性對照（β2毒素強毒菌C59-44）進行ELISA檢測，結果表明，表達蛋白能夠被β2毒素抗體識別（表1）。

2.4 培養基pH對β2蛋白表達的影響

不同pH培養基明顯影響目的蛋白的表達，pH 7.0培養基培養，目的蛋白表達量最高，凝膠成像儀分析表明，目的蛋白的表達量占菌體總蛋白相對含量的30.2%（圖4）。

2.5 誘導溫度對β2蛋白表達的影響

誘導溫度對目的蛋白表達影響也比較大，37 ℃時進行誘導，目的蛋白表達量最高，凝膠成像儀分析結果表明，目的蛋白的表達量占菌體總蛋白相對含量的32.5%（圖5）。

2.6 IPTG誘導濃度對β2蛋白表達的影響

IPTG誘導濃度不同對目的蛋白表達量的影響也不同，終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導時目的蛋白表達量最高，凝膠成像儀分析結果表明，目的蛋白的表達量占菌體總蛋白相對含量的30.8%（圖6）。

2.7 誘導時間對β2蛋白表達的影響

隨著誘導時間的增加，β2蛋白表達量也逐漸增加，當IPTG誘導培養4 h后，目的蛋白表達量最高，凝膠成像儀分析結果表明，目的蛋白的表達量占菌體總蛋白相對含量的29.8%（圖7）。

綜上所述，重組菌株BL21（DE3）（pETXB2）優化表達條件是培養基pH 7.0、培養溫度37 ℃時，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG誘導4 h，此時表達效果較理想。

3 小結與討論

利用PCR擴增技術，以產氣莢膜梭菌中國標準株（C59-44）基因組DNA為模板，擴增了β2毒素基因并連接到表達載體pET-28c上，構建了重組菌株BL21（DE3）（pETXB2），并證實其含有β2毒素基因表達質粒，同時利用IPTG誘導對重組菌株BL21（DE3）（pETXB2）表達進行調控。外源基因在宿主菌中的表達涉及到宿主、載體和環境多種因素的影響。因此，通過改變一個因素來優化多種影響因素從而使目的蛋白表達最大化。本研究通過固定其他參數來優化單一因素，最終對影響目的蛋白表達量的多個關鍵因素實現最佳優化。

本研究通過調控大腸桿菌pET表達系統上的乳糖（Lac）操縱子實現目的蛋白表達。誘導劑通過開啟lacUV5啟動子從而過量表達T7RNA聚合酶并最終產生大量目的蛋白。IPTG作為常規的誘導劑因不被菌體所利用且不會有復雜的代謝過程而被廣泛使用，但昂貴的價格和對菌體的毒性限制了其在實際生產中的應用。所以為了降低IPTG對大腸桿菌代謝毒性并減少實際大規模生產中的費用，有必要確定IPTG的最低有效濃度。本研究結果顯示，在終濃度為0.8 mmol/L時β2毒素蛋白表達量最大。溫度對表達產物的影響比較大，主要通過影響反應過程中酶的反應速率進而影響蛋白性質，當37 ℃誘導時，β2毒素蛋白表達量達到最高。pH明顯影響目的蛋白表達，當培養基pH為7.0并振蕩培養至對數生長期，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG培養4 h，β2毒素蛋白表達量最高。誘導時間對蛋白表達影響也很大，在一定時期的誘導過程中，目的蛋白表達逐漸增加，達到最大值產量后，會隨著時間推移逐漸降解從而降低產量，結果顯示誘導4 h可使表達產物達到最大化。本研究通過參數的改變從而使表達條件達到最佳，最終實現了目的蛋白表達的最大化，其最佳的表達條件是在37 ℃，pH 7.0的培養基中，用終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導4 h，β2毒素蛋白的表達效果最好。

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