正交設計優選白洋淀蘆根中阿魏酸的提取工藝

李洪　張靜　王麟　王曉欣　高玉梅

【摘 要】目的：正交設計優選白洋淀蘆根中阿魏酸甲醇回流法最佳提取工藝。方法：用正交實驗法，以阿魏酸含量為考察指標，對甲醇濃度、回流次數、甲醇用量等影響因素進行研究，優選最佳提取工藝。結果：最佳工藝為加10倍量70%甲醇，回流提取2次，每次45分鐘。結論：用該工藝提取效率高穩定性好，為從白洋淀蘆根中提取阿魏酸提供了參考依據。

【關鍵詞】阿魏酸；正交試驗；白洋淀蘆根；提取工藝

0 引言

蘆根為禾本科植物蘆葦新鮮或者干燥根莖[1]，它性寒、味甘，入肺、胃經，具有清熱瀉火、生津止渴、除煩、止嘔、利尿之功效，臨床常用于熱病煩渴，肺熱咳嗽，肺癰吐痰，胃熱嘔吐，熱淋澀痛等癥的治療。蘆根作為中國傳統藥物，在中醫臨床治療中有著廣泛的應用[2-3]。而白洋淀地區的蘆葦資源豐富，自古就有“蘆葦之鄉，甲于河北”的美譽。該地區出產的蘆根產量大、質量好，作為河北省特色藥材，是北方地區蘆根藥材的重要來源之一。經查閱相關文獻，發現目前關于蘆根藥材的質量控制研究較少，主要是以阿魏酸的高效液相含量測定和藥材HPLC指紋圖譜為主[4-6]，而關于白洋淀地區蘆根的研究更是未見報道，缺乏白洋淀蘆根相關的質量控制標準及方法。本研究通過以阿魏酸為指標，采用高效液相色譜（HPLC）法，觀察不同提取時間、提取次數、溶劑用量及提取溶劑的濃度對白洋淀蘆根中阿魏酸提取的影響，選取最佳提取工藝，為白洋淀蘆根的質量控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀Agilent 1100（美國安捷倫科技有限公司）；CX-250型超聲波清洗器（北京醫療設備二廠）；電熱恒溫水浴鍋（天津中環實驗電爐有限公司）；賽多利斯BS210S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；乙醇濃度檢測儀（河北省河間市宏利儀表廠）；白洋淀蘆根（購自安國金康迪中藥飲片廠）；乙腈、甲醇為色譜純；水為屈臣氏蒸餾水；阿魏酸（中國藥品生物制品檢定所，批號：110773-200813）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈-水溶液（26：2：72）；檢測波長：320 nm；流速：1.0 mL/min。

1.2.2 考察因素選取

白洋淀蘆根中主要活性成分阿魏酸易溶于甲醇[4]，因此確定甲醇為提取溶劑，以阿魏酸為檢測指標，觀察提取時間、提取次數、甲醇用量（相對于藥材質量）及甲醇濃度為考察因素，每個因素設定3個水平層次（見表1），采用4因素3水平8次[L9（34）]正交試驗進行研究測定。

表1 相關因素的3個水平層次劃分表

1.2.3 供試品溶液制備

按處方比例分別稱取5種中藥材，放入具塞錐形瓶中，精密稱重，分別用規定濃度的甲醇按照正交設計進行超聲提取9次，放涼，再用同等濃度甲醇補足重量，定容，稱重，合并提取液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，備用。

1.2.4 對照品溶液制備

精密稱取阿魏酸對照品7.20mg，置100mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻；從中精密吸取5mL至10mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，作為阿魏酸對照品溶液。

1.2.5 標準曲線制備

精密吸取對照品溶液1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL注入液相色譜儀，按1.2.1項色譜條件下記錄色譜圖，測定峰面值。以阿魏酸素峰面積值為縱坐標，進樣量為橫坐標，做線性回歸，得回歸方程：Y=7.73×104X-1.84×104，r=0.999 9。結果表明，阿魏酸對照品在0.038-0.38μg的范圍內進樣量和峰面積與峰面積呈現良好的線性關系。

1.2.6 樣品測定

精密吸取供試品溶液15 μL，注入高效液相色譜儀，按1.2.1項色譜條件下記錄色譜圖，測定其峰面積值。

2 結果及分析

2.1 L9（34）正交試驗結果（見表2）

表2 L9（34）正交試驗結果

表3 方差分析表

注：F0.05（2，2）= 19.00； F0.01（2，2）= 99.00

由表2、表3可見，以阿魏酸為指標，對白洋淀蘆根中阿魏酸提取工藝因素影響大小是：A> D > B > C，A因素對提取工藝影響最大，即提取時間，B、C、D因素因素在實驗水平上的影響無顯著意義。正交實驗結果顯示，白洋淀蘆根中阿魏酸的提取工藝最佳條件：A2 B2 C3 D2，即采用10倍藥材量的70%乙醇，提取2次，每次45 min。

2.2 工藝驗證

取白洋淀蘆根適量，按照最佳工藝條件確定的提取時間、提取次數、乙醇用量及濃度，平行試驗測定3組（見表4）。

表4 工藝驗證

由表4可見，本方法檢驗結果穩定可靠。

3 討論

本研究選取阿魏酸為測定白洋淀蘆根的觀測指標，采用HPLC法檢測，以甲醇為提取試劑。取適量阿魏酸對照品，加甲醇制成溶液，用紫外分光光度計掃描，結果在320 nm處有最大吸收，參考2010年版《中華人民共和國藥典》，確定檢測波長是320 nm。經L9（34）正交試驗得出影響白洋淀蘆根中阿魏酸提取工藝的因素：提取時間>提取次數>乙醇用量>乙醇濃度，提取時間因素對提取工藝影響最大。冠心2號凍干粉針劑最佳提取工藝條件為：用藥材10倍量75%的乙醇，提取2次，每次45min。本方法簡便易行，準確可靠，可用于白洋淀蘆根的質量控制與檢測。

【參考文獻】

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：152-153.

[2]曾立昆.大劑干蘆根治療肺膿瘍[J].浙江中醫雜志，1995（2）：87.

[3]張福生，陳學玉.蘆根沖劑防治感冒效果觀察[J].長治醫學院學報，1994，5（1）：86-87.

[4]陳純，康志英.不同產地蘆根hplc指紋圖譜研究[J].湖南中醫雜志，2008，24（4）： 102-103.

[5]代雪平，宋漢敏，李振國.Hplc法測定不同產地蘆根中阿魏酸的含量[J].中醫研究，2010，23（9）：26-27.

[6]曾志，張艷萍，李核等.蘆根液相色譜指紋圖譜研究[J].中成藥，2005，27（4）：373-377.

[責任編輯：楊玉潔]