不同灸法艾灸血清對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞的影響 *

不同灸法艾灸血清對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞的影響*

劉鰩1張付平1王蕾1馬文彬2劉旭光2李軒漾1周海燕2

(1.四川大學華西基礎醫學與法醫學院組織胚胎學和神經生物學教研室， 四川 成都 610041；

2.成都中醫藥大學針灸推拿學院， 四川 成都 610075；)

【摘要】目的探討不同灸法艾灸血清對類風濕關節炎(RA)滑膜成纖維細胞的影響，揭示不同艾灸方法對實驗性RA抗炎效應的作用機制。方法用直接灸、溫和灸、隔姜灸三種不同艾灸方法刺激實驗性RA大鼠“腎俞”、“足三里”穴,收集血清，用艾灸血清作用于大鼠RA滑膜成纖維細胞,倒置顯微鏡觀察各細胞形態。結果不同灸法“艾灸血清”培養RA模型大鼠膝關節滑膜成纖維細胞48h后，RA滑膜成纖維細胞狀態變好，其形態逐漸接近于正常滑膜成纖維細胞，其中以隔姜灸組最為明顯。結論艾灸治療有改善病理性炎性滑膜成纖維細胞生長狀態，可起到促進其向正?；D歸的作用，不同灸法中以隔姜灸法治療效果最為明顯。

【關鍵詞】類風濕性關節炎； 直接灸； 溫和灸； 隔姜灸

【中圖分類號】R 245.81; R 593.32

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.10.002

Abstract【】ObjectiveTo study the effect of different moxibustion serum on rheumatoid arthritis (RA) synovial fibroblasts and explore the mechanism of different moxibustion methods in treatment of experimental RA. MethodsDirect moxibustion, warm-moxibustion and ginger moxibustion methods were employed to stimulate the “Shenshu”(BL23)and “Zusanli”(ST36)regions of experimental RA rats. The serum of experimental RA rats was collected and used to culture RA synovial cells. Cell morphology was observed and recorded using inverted microscopy. ResultsThe morphology of RA synovial cells was gradually approach to normal synovial fibroblasts after culturing with different moxibustional serum for 48h. The ginger-partitioned moxibustion group had the most significant changes. ConclusionMoxibustional treatment can improve the RA synovial cell growth state and promote the RA synovial fibroblasts recovery. The ginger group has the most obvious effect.

基金項目：國家自然科學基金(81173319)

通訊作者：王蕾， E-mail：327867291@qq.com; Tel：13398193355；

收稿日期：( 2015-04-01； 編輯： 何興華)

Effect of different moxibustion serum on rheumatoid arthritis synovial fibroblastsLIU Yao1，ZHANG Fuping1, WANG Lei1，etal

(1.DepartmentofHistology,EmbryologyandNeurobiology，WestChinaSchoolofBasicand

ForensicMedicine，SichuanUniversity，Chengdu610041，China；

2.SchoolofAcupunctureandMassage，ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu610075，China)

【Key words】Rheumatoid arthritis； Direct moxibustion； Warm moxibustion； Ginger-partitioned moxibustion

類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種以慢性對稱性多關節炎表現為主的全身性自身免疫疾病。以滑膜增生、血管翳形成及軟骨與骨組織破壞為特征的滑膜炎癥是RA的關鍵病理環節[1]。艾灸作為中醫傳統療法，對RA 的治療具有確切的療效[2],且不同灸法(傳統灸法大體上可分為直接灸、溫和灸、隔物灸三大類)具有不同的抗炎效應。既往大量在體實驗研究已從神經內分泌免疫調節途徑和滑膜細胞靶點效應角度對艾灸治療RA的作用原理進行了較深入的探索，但是艾灸及不同灸法對RA滑膜成纖維細胞作用的具體細節卻少見報道。在本文中，我們建立體外RA滑膜成纖維細胞模型，觀察不同灸法艾灸血清對實驗性RA滑膜成纖維細胞的直接影響過程，為研究艾灸治療RA的作用機制提供實驗證據。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1動物與分組SPF級SD大鼠50只，體重(250±0.25)g，雌雄各半，由四川大學動物試驗中心提供。

1.1.2主要試劑高糖DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶(Hyclone,美國);胎牛血清(Gibco，美國);福氏完全佐劑(FCA)、二甲基亞砜(均為美國Sigma公司產品)；血管細胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule，VCAM1)抗體、骨成型蛋白受體(Bone morphogenetic protein receptor，BMPR)抗體(Santa Cruz公司)、艾絨(南陽市臥龍漢醫艾絨廠)。

1.2　方法

1.2.1RA模型建立SD大鼠隨機分為空白對照組、RA模型組、直接灸組、溫和灸組與隔姜灸組，每組10只。于實驗開始第一天，將各組動物雙側膝關節周圍剃毛，用75%酒精消毒，輕度彎曲膝關節。模型組及艾灸組以膝關節髕骨下緣、髕韌帶外側凹陷為穿刺點，將FCA(0.5mL/kg)平均注射于雙后膝關節腔內，造成大鼠膝關節佐劑性關節炎，對照組采用相同方法注入等體積生理鹽水[3]。

1.2.2艾灸治療造模后第七天將艾灸組大鼠固定，暴露背部及膝關節(治療穴位部位剃毛2cm×2cm)。將艾絨制成的艾粒(5mg/壯)分別用直接灸(于艾粒底部涂少量凡士林固定于大鼠的穴位)，溫和灸(將艾粒點燃后對準穴位，距離皮膚約5mm)，隔姜灸(將艾粒放在厚度約1mm，大小為2.5cm×2.5cm的姜片中央，待艾粒燃盡后移除再換上新的艾粒)三種不同方法施灸“腎俞”“足三里”穴(參照《實驗針灸學》的動物穴位圖譜)各5壯,雙側交替進行，每日1次。6天為1療程,共治療3個療程,療程之間休息1天。正常對照組和模型組動物同法固定,但不治療。

1.2.3艾灸血清制備治療第21天,對正常對照組和各艾灸治療組動物心臟無菌取血,室溫靜置20min后1500r/min離心10min，取上清,同組血清混合、分裝,-20℃凍存備用。

1.2.4細胞原代培養、傳代培養、純化與鑒定治療21天后，處死對照組及模型組大鼠，在嚴格消毒的條件下打開雙后肢膝關節，用手術剪剪切位于關節腔內側面的滑膜組織,放入盛有PBS(含青、鏈霉素各10萬u/L)的培養皿中,然后移至超凈工作臺，用PBS洗三遍后再用含20%胎牛血清的DMEM培養基洗三遍。將組織剪成1cm×1cm×1cm的小塊植入3.5cm培養皿中，小塊間距約0.5cm均勻擺放，加入約500ul培養基剛好濕潤組織塊移至37℃、5%C02培養箱中培養，48h后補加培養基至2ml，繼續培養。當原代細胞長至培養皿的80%以上時，用0.25%的胰酶消化后離心，重懸后傳代培養，當傳至3～4代時，用VCAM、BMPR抗體進行鑒定，取3～4代細胞液氮凍存，取3～7代細胞用于實驗。

1.2.5細胞形態觀察倒置顯微鏡觀察正常滑膜成纖維細胞、RA炎性滑膜成纖維細胞、以及用各艾灸治療組血清培養48h后RA滑膜成纖維細胞的細胞形態。

首先，全球林產品貿易格局將進一步調整，未來傳統的勞動力密集型林產品、資本密集型林產品將逐步讓位于技術密集型林產品。特別是歐美發達國家利用其森林資源、市場、資本、管理和科技等方面的競爭優勢，在高端產品領域將繼續占據制高點，并在全球技術密集型林產品貿易中處于主體地位；而越南、柬埔寨發、緬甸、印尼等發展中國家將主要利用勞動力的價格優勢在林產品國際貿易中搶占有利位置，成為中國的主要競爭對手;俄羅斯、南美、非洲和太平洋島國等將利用其森林資源優勢，進一步強化原木出口禁令，同時加快產業結構調整，林產品生產和貿易水平有望不斷提升。

2結果

2.1正?；こ衫w維細胞形態原代培養3d左右,倒置顯微鏡下可見組織塊邊緣有少量橢圓形、三角形或梭形細胞長出，7d后組織塊周圍有較明顯的成纖維細胞長出,以后逐漸增多并向四周呈放射樣生長。由于滑膜成纖維細胞在體外生長迅速，可抑制滑膜巨噬細胞的生長，經傳代培養純化后，圓形的滑膜巨噬細胞逐漸消失,而以成纖維樣滑膜細胞生長為主，至第三代時成纖維樣細胞所占比例>90%，其細胞呈多邊形或長梭形，有兩個或多個突起(圖1a)。經特異性抗體VCAM鑒定證實為滑膜成纖維細胞(圖1b)。

2.2RA炎性滑膜成纖維細胞形態與正?；こ衫w維細胞相比，RA炎性滑膜成纖維細胞形態變圓，細胞邊緣不清晰，細胞突起變得不明顯，細胞內出現顆粒狀及空泡狀物質(圖2a)。經特異性抗體BMPR鑒定證實為RA炎性滑膜成纖維細胞(圖2b)。

圖1正?；こ衫w維細胞

Figure 1The normal synovial fibroblasts

注：a.第三代滑膜成纖維樣細胞呈多邊形或長梭形，有兩個或多個突起(×100)； b.特異性抗體VCAM鑒定結果為陽性(×400)

圖2RA炎性滑膜成纖維細胞

Figure 2The RA synovial fibroblasts

注：a. RA炎性滑膜成纖維細胞變圓，邊緣不清，突起不明顯，胞內現顆粒狀及空泡狀物質(×200)； b.特異性抗體BMPR鑒定結果為陽性 (×400)

2.3不同灸法艾灸血清培養RA滑膜成纖維細胞48h后的細胞形態用不同灸法艾灸血清培養RA滑膜成纖維細胞48h后，與對照組相比，各艾灸組細胞變為梭形，細胞變得光滑飽滿，細胞之間通過突起連接更加緊密，細胞中空泡狀及顆粒狀物質減少，其中以隔姜灸組最為顯著(圖3a～d)。

圖3不同灸法艾灸血清培養RA滑膜成纖維細胞48h后的細胞形態

Figure 3The morphological of RA synovial fibroblasts after culturing with different moxibustional serum for 48h

注：a.對照組，b.直接灸組，d.溫和灸組, d.隔姜灸組；與對照組相比，各艾灸組細胞變得光滑飽滿，細胞中空泡狀及顆粒狀物質減少，其中隔姜灸組最為顯著。

3討論

成纖維樣滑膜細胞(FLC)是炎性滑膜炎中組織損傷和基質重塑的直接效應細胞，在RA發病機制中起著重要作用。滑膜成纖維細胞能通過分泌金屬蛋白酶等途徑介導關節破壞，同時通過刺激破骨細胞的生成來促進骨的吸收，再者，它們還能通過釋放表皮生長因子、血管內皮生長因子等刺激血管生成，通過釋放趨化因子招募白細胞進入關節，從而誘導滑膜炎癥[4-5]。針對RA滑膜炎癥的關鍵病理環節，高駿等[6-8]證明，艾灸治療能抑制滑膜細胞中NF-κB、MAPK、JAK-STAT等炎性信號傳導途徑；李秀坤等[9-11]發現艾灸能明顯減少RA滑膜細胞對IL-1、TNF-α、PDGF(血小板衍生因子)、EGF(上皮生長因子)、ICAM-1(細胞間粘附分子)等炎癥相關因子的分泌，楊涵棋等研究報道[12-13]，直接灸、溫和灸、隔姜灸三種不同灸法均能明顯降低RA模型動物關節滑膜液中IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1的含量，其中隔姜灸最為顯著。

近年來“針灸血清”研究方法的提出[14],為直接觀察針灸對細胞、離體組織等的影響提供了重要的思路和方法。所謂“針灸血清”是指艾灸或針刺治療后的人或動物血清，將此作為效應物質加入到另一個反應系統中，此系統可以是離體器官、組織、細胞或分子等，通過觀察反應前后其功能或形態改變，直接反應針灸處理后產生的效應[15]。本文中，我們用不同艾灸方法治療組大鼠血清作用于體外培養的RA滑膜成纖維細胞，實驗結果顯示,用三種不同灸法的艾灸血清培養RA炎性滑膜成纖維細胞后，細胞由圓形、不規則形的炎性細胞形態轉變為長梭形的正?；こ衫w維樣細胞形態，其中隔姜灸組最為明顯?？赡苁前闹委熀笠鹧逯心承┗钚晕镔|含量有意義的改變，從而能有效減輕RA模型動物滑膜炎性反應，使RA炎性滑膜成纖維細胞逐漸向正常細胞轉化。

4結論

本研究用直接灸、溫和灸、隔姜灸三種不同灸法刺激實驗性RA大鼠“腎俞”、“足三里”穴，收集各艾灸治療組血清培養炎性滑膜成纖維細胞。結果顯示，經不同灸法艾灸血清作用48h后，大鼠RA滑膜成纖維細胞形態得到改善，由圓形、不規則形的炎性細胞形態轉變為長梭形的正?；こ衫w維樣細胞形態，以隔姜灸法治療效果最為明顯。本研究結果提示艾灸治療可改善病理性炎性滑膜成纖維細胞生長狀態，并具有促進其向正?；D歸的作用。

【參考文獻】

[1]Firestein GS. Invasive fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Passive responders or transformed aggressors[J]. Arthritis Rheum, 1996, 39(11): 1781-1790.

[2]黃迪君，韓哲林，羅榮．麥粒灸對實驗性RA大鼠足跖腫脹度及滑膜組織caspasse-3表達的影響[J]．成都中醫藥大學學報，2003，26(2)：29-30.

[3]楊涵棋，劉旭光，楊馨，等.不同灸法對類風濕關節炎家兔腫脹關節及滑膜液中白介素-1、腫瘤壞死因子-α表達的影響[J].針刺研究，2013，38(2)：134-139.

[4]Jackson JR, Minton JA, Ho ML,etal. Expression of vascular endothelial growth factor in synovial fibroblasts is in-duced by hypoxia and interleukin1beta[J].J Rheumatol,1997,24(7):1253-1259.

[5]奚正德，李寧麗，張雁云，等.滑膜成纖維細胞在關節炎發病中的作用[J].自然雜志，2004,26(4)：205-208.

[6]高駿，劉旭光.持續光照對艾灸調控類風濕性關節炎大鼠褪黑激素與類風濕性關節炎血漿1L-1β、1L-4 水平的影響[J].遼寧中醫雜志，2011，28(8)：1677-1680.

[7]楊馨，楊慎峭. 艾灸對實驗性 RA 家兔滑膜細胞MAPK 信號通路影響的研究[J].中華中醫藥學刊，2007，25(3):470-473.

[8]楊馨，李繼書.艾灸對實驗性類風濕性關節炎家兔滑膜細胞JAK-STAT信號通路影響的研究[J]. 針刺研究，2007，32(2):75-82.

[9]李秀坤，劉旭光.艾灸對實驗性RA家兔滑膜組織PEG2表達的影響[J].針灸研究，2006，12(10)：774-776.

[10] 黃迪君,余曙光,韓哲林.麥粒灸對實驗性RA大鼠局部組織炎癥介質的影響[J].上海針灸雜志,2002,21(4):43-44.

[11] 章鳴，高根德.羧甲基幾丁糖對兔佐劑性關節炎滑膜細胞體外培養影響實驗研究[J].浙江臨床醫學,2002,4(6):405-406.

[12] 王昌富，王艷嬌，李琳蕓，等.類風濕關節炎患者血清白介素-6、血管性血友病因子的臨床研究[J].血栓與止血學，2012，18( 2)：72-74.

[13] 楊涵棋，劉旭光，張耀，等.不同灸法對實驗性RA 模型IL-6、IL-8、MCP-1 表達影響的研究[J]. 中華中醫藥學刊，2012,30(12)：2625-2627.

[14] 陳漢平,裴建.關于“針灸血清”方法的研究和應用[J].上海針灸雜志,1998，1(17)：1-2.

[15] 孫德利，陳漢平.“針灸血清”的研究方法及意義[J].浙江中醫學院學報，1999，23 (3) ：59.

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