糖尿病和糖尿病足潰瘍患者淋巴管內皮祖細胞改變及其影響因素研究

糖尿病和糖尿病足潰瘍患者淋巴管內皮祖細胞改變及其影響因素研究

魏民，陳存舉，馮進，高玲

(中國人民武裝警察8730部隊醫院，廣東 廣州 510800)

摘要：目的 探討糖尿病患者和糖尿病足潰瘍患者外周血淋巴管內皮祖細胞的改變及其影響因素。 方法 采用RT-PCR檢測外周血白細胞中淋巴管內皮祖細胞標志物VEGFR3mRNA表達；采用免疫組織化學檢測外周血白細胞VEGFR3蛋白表達，并計數VEGFR3陽性細胞數量；檢測各組患者臨床指標，分別和外周血VEGFR3表達進行統計學相關分析。 結果 與正常對照組比較，實驗組外周血VEGFR3mRNA表達及VEGFR3蛋白表達減少，差異有統計學意義(P<0.01)。糖尿病1組(HbA1C<7%)與正常對照組比較，VEGFR3陽性細胞數量減少，差異有統計學意義(P<0.05)；糖尿病2組(HbA1C≥7%)和糖尿病足組與正常對照組比較，VEGFR3陽性細胞數量減少(P<0.01)。相關因素分析顯示： VEGFR3表達的影響因素為糖化血紅蛋白、空腹血糖、收縮壓、舒張壓。結論 糖尿病及糖尿病足潰瘍患者外周血淋巴管內皮祖細胞標志物VEGFR3表達減少，且和糖化血紅蛋白、空腹血糖、收縮壓、舒張壓呈負相關。

關鍵詞：糖尿病；糖尿病足；淋巴管內皮祖細胞

中圖分類號：R587.1

文獻標識碼：A

文章編號：2095-4646(2015)04-0287-03

ABSTRACT：Objective To explore changs of lymphatic endothelial progenitor cells and its affecting factorsin peripheral blood leukocytes of diabetes patients and diabetic foot ulcer patients. Methods The gene expression of VEGFR3 was detected by RT-PCR，the protein expression of VEGFR3 was determined by immunohistochemistry，and the correlative factors were analyzed by statistical methods.Results Compared with normal control group，the gene and protein expression of VEGFR3 in diabetes group and in diabetic foot ulcer group were significantly decreased(P<0.01).Number of positive cells of VEGFR3 in peripheral blood of diabetes group and diabetic foot ulcer group was decreased than that of normal control group(P<0.01).The correlative analysis showed that factors decreasing VEGFR3 expression included HbA1C，systolic pressure，fasting blood-glucose and diastolic pressure.Conclusion The expression of VEGFR3 is decreased in peripheral blood of diabetes patients and diabetic foot ulcer patients，and there has negative correlation between VEGFR3 expression and HbA1C，systolic pressure，fasting blood-glucose and diastolic pressure.

收稿日期：(2015-05-13)

Changs of Lymphatic Endothelial Progenitor Cells and its Affecting

Factorsin Diabetes and Diabetic Foot Patients

WEI Min，CHEN Cun-ju，FENG Jin，et al

(DepartmentofInternalMedicine，8730ArmyHospitalofCAPF，GuangzhouGuangdong510515，China)

KEY WORDS：Diabetes;Diabetic foot;Lymphatic endothelial progenitor cell

糖尿病足潰瘍是糖尿病的慢性并發癥之一，難愈合的潰瘍可能最終導致截肢，嚴重影響患者的生存和生活質量。盡管2型糖尿病患者足部潰瘍皮膚神經、血管病變顯著，但是潰瘍并不延遲愈合[1]，推測尚有其他因素參與潰瘍的修復。我們以往的研究發現：在糖尿病足潰瘍組織中淋巴管內皮細胞標志物VEGFR3和 LYVE-1表達減少，可能與潰瘍局部皮膚組織中淋巴管內皮重建不足，并且和潰瘍難愈合相關[2，3]。為進一步探討潰瘍皮膚淋巴管數量減少的原因，本研究以糖尿病患者和糖尿病足潰瘍患者外周血白細胞為研究對象，以期探討在糖尿病患者和糖尿病足潰瘍患者外周血淋巴管內皮祖細胞標志VEGFR3表達、淋巴管內皮祖細胞數量的改變以及其影響因素。

1資料與方法

1.1一般資料收集我院住院部符合納入標準的糖尿病足潰瘍患者以及同時期住院的糖尿病患者作為研究對象，正常對照采用同時期門診知情同意的健康體檢者。納入標準：足部創面形成大于1個月，內科治療無愈合傾向[2，3]。排除標準：惡性潰瘍創面、特異性感染創面(結核、真菌及破傷風創面)；嚴重的心、肝、腎功能不全者；使用糖皮質激素治療者；踝肱比≤0.9，跨皮氧分壓<30mmHg。研究對象分為4組，分別為：糖尿病足潰瘍組(diabetic foot，DF組)10例，男5例，女5例；年齡(52.30±4.66)歲；糖尿病病程(5.94±1.44)年；糖尿病足潰瘍出現時間(64.00±10.38)d，平均潰瘍面積0.8cm×1.7cm。糖尿病1組，(HbA1C<7%，DM1組)10例，男6例，女4例；年齡(54.14±5.65)歲；糖尿病病程(5.80±1.62)年。糖尿病2組(HbA1C≥7%，DM2組)10例，男5例，女5例；年齡(54.22±6.38)歲；糖尿病病程為(6.10±1.73)年。以上患者糖尿病符合1999年WHO診斷標準，均為2型糖尿病患者。正常對照組(NC組)10例，男7例，女3例；年齡(57.32±4.46)歲，為同時期門診知情同意的健康體檢者。

1.2檢測方法采用RT-PCR檢測各組患者外周血白細胞中淋巴管內皮細胞標志物VEGFR3mRNA的表達。取各組標本按照RT-PCR試劑盒說明書方法進行總RNA提取和逆轉錄實驗，凝膠分析系統分析結果。VEGFR3引物序列：上游TGTTGGAGGTTAAGGCATACG；下游CGGGCTCTAAAGGGAAGAA；擴增長度為526bp。內參引物序列：上游AGCGAGCATCCCCCAAAGTT；下游GGGCACGAAGGCTCATCATT，長度為285 bp(上海英駿公司合成)。

采用免疫熒光化學法檢測各組研究對象的VEGFR3蛋白表達以及VEGFR3陽性細胞的數量。取各組研究對象1ml，調整細胞濃度為2.0×106/ml，分別取0.2ml制作成細胞貼片，每例研究標本做成5張細胞貼片，參照免疫組織化學試劑盒說明書進行操作和染色。采用MIAS2000高清晰度病理圖文報告系統分析各組VEGFR3陽性細胞蛋白表達及VEGFR3陽性細胞數量(每例標本隨機取5個視野計數陽性細胞數量)。

收集各組實驗對象的臨床指標，與外周血白細胞VEGFR3表達做相關性統計學分析。

1.3統計學方法采用SPSS 13.0統計軟件進行數據統計，數據采用均數±標準差表示，各組之間VEGFR3mRNA比較采用非參數檢驗，其余多組之間比較采用one-way ANOVA方法，方差不齊則采用多組間非參數檢驗，組間比較采用SNK比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1RT-PCR結果VEGFR3mRNA在各組中均有表達，因為各組VEGFR3mRNA表達數值方差不齊，故采用非參數檢驗，四組比較VEGFR3mRNA表達差異有統計學意義，見表1。

表1　各組外周血白細胞中VEGFR3mRNA表達的比較( ± s)

表1　各組外周血白細胞中VEGFR3mRNA表達的比較( ± s)

分組例數VEGFR3mRNAMeanRankNCDM1DM2DF101010101.292±0.0371.037±0.0670.634±0.073*0.5880±0.009*35.5025.5012.508.50

與NC組比較，*P<0.01

2.2VEGFR3蛋白表達結果VEGFR3蛋白在各組中均有表達。在顯微鏡下，每張載玻片分別選取5個視野，使用MIAS-2000高清晰度計算機病理圖文報告系統，以每例標本表達量最強的 5個高倍視野(×400)的積分光密度值作為該例的測定值。DM2、DF和NC組比較，VEGFR3蛋白表達減少，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2　各組VEGFR3熒光強度積分光密度值比較( ± s)

表2　各組VEGFR3熒光強度積分光密度值比較( ± s)

分組例數積分光密度值NCDM1DM2DF10101010169.900±7.795111.600±5.66186.400±7.168*82.200±8.626*

與NC組比較，*P<0.01

2.3VEGFR3陽性細胞數量比較結果在顯微鏡下，每張載玻片分別選取5個視野，計數每個視野中的陽性細胞數量，以上結果由2個人完成，取2人結果的平均值。從細胞計數結果分析：DM1組與NC組比較，VEGFR3陽性細胞數量減少(P<0.05)；DM2組和DF組與正常對照組比較，VEGFR3陽性細胞數量顯著減少(P<0.01)，見表3。

表3　各組VEGFR3陽性細胞數量的比較( ± s)

表3　各組VEGFR3陽性細胞數量的比較( ± s)

分組例數細胞數量(個)NCDM1DM2DF1010101037.24±6.0232.06±4.55*17.04±2.25**20.50±2.52**

與NC組比較，*P<0.05、**P<0.01

2.4外周血白細胞VEGFR3表達的相關臨床因素分析相關因素分析結果：外周血白細胞VEGFR3表達的相關影響因素為空腹血糖(Spearman's r=-0.518，P=0.003)；收縮壓(Spearman's r=-0.551，P=0.002);舒張壓(Spearman's r=-0.391，P=0.033)；糖化血紅蛋白(Spearman's r=-0.625，P=0.000)；與甘油三酯、膽固醇、空腹C肽，餐后2hC肽無相關性，見表4。

表4　VEGFR3表達和臨床指標相關性分析(n=10， ± s)

表4　VEGFR3表達和臨床指標相關性分析(n=10， ± s)

項目DM1DM2DF相關系數P空腹血糖(mmol/L)8.85±2.3213.88±6.8410.93±2.68-0.520.00甘油三酯(mmol/L)1.21±0.663.19±5.921.57±0.91-0.180.34膽固醇(mmol/L)3.72±1.356.37±4.843.90±1.07-0.220.24收縮壓(mmHg)119.80±7.32129.70±29.08139.50±22.45-0.550.00舒張壓(mmHg)71.50±8.2977.40±15.0377.40±7.40-0.390.03糖化血紅蛋白(%)6.59±0.2611.40±2.238.92±1.96-0.630.00空腹C肽(ng/L)1.69±1.361.26±0.971.18±0.840.060.75餐后2hC肽(ng/L)3.50±2.352.36±2.232.22±2.070.180.35

3討論

有研究發現，淋巴管內皮細胞除了參與胚胎正常淋巴管發育[4]、腫瘤轉移等過程外，還參與組織修復、炎癥反應[5]等過程。在創面組織修復過程中，無論是炎癥急性反應階段，還是慢性反應階段，淋巴管的形成都發揮了重要的作用[6]。VEGFR3是淋巴管內皮細胞的標志物，也是淋巴管內皮祖細胞的標志物。

本研究以糖尿病患者和糖尿病足非缺血性潰瘍患者外周血白細胞為研究對象，分別檢測各組外周血白細胞中的VEGFR3表達以及VEGFR3陽性細胞的數量，并將VEGFR3表達和臨床指標進行了相關性分析，進一步探討糖尿病足潰瘍患者和糖尿病患者外周血中VEGFR3表達的影響因素。RT-PCR結果顯示：各組細胞均有VEGFR3mRNA表達。通過非參數檢驗的Mean Rank分析：NC組和DM1組的VEGFR3mRNA表達高于DF組和DM2組(P<0.01)。表明外周血白細胞中VEGFR3mRNA表達減少對于DF組和DM2組更有意義。細胞免疫熒光化學的結果顯示：計數5個高倍視野中的積分光密度值，結果為DM2組、DF組與NC組比較，VEGFR3蛋白表達減少，差異有統計學意義(P<0.01)，DM1組和NC組比較無統計學差異。在相同細胞濃度和相同視野的細胞涂片中，我們計數了每組計數10個標本，每張標本分別計數了鏡下5個視野，NC組的VEGFR3陽性細胞數量最多，DM1組其次，DF組和DM2組最少。VEGFR3表達量的相關因素分析結果表明：空腹血糖、收縮壓、舒張壓和糖化血紅蛋白與VEGFR3表達呈負相關，與甘油三酯、膽固醇、空腹C肽，餐后2hC肽無顯著相關性。我們的研究證實空腹血糖升高和糖化血紅蛋白與外周血中VEGFR3陽性細胞數量減少有關。在以往的研究中已經證實[7]：糖尿病患者外周血中血管內皮祖細胞減少，可能與氧化應激、血紅素加氧酶表達以及脂聯素有關。而高血壓導致外周血管內皮祖細胞減少的原因可能為：氧化應激和炎癥等[8]。但是高血糖、高血壓導致淋巴管內皮祖細胞減少的具體原因有待今后的研究繼續探討。

綜上所述，我們推測糖尿病患者在血糖控制欠佳或者合并高血壓的情況下，骨髓淋巴管內皮祖細胞釋放減少，導致了外周血中的淋巴管內皮祖細胞數量減少。如果此時合并足部潰瘍，則在潰瘍局部不能形成足夠的淋巴管，從而影響了局部創面的炎癥反應，延長了創面的愈合時間。所以，糖尿病患者淋巴管內皮祖細胞數量減少是糖尿病足潰瘍皮膚淋巴管內皮形成障礙的原因之一。

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