雌激素對蛛網膜下腔出血后P2X7受體及神經炎癥反應的影響

徐曉雨　陳　輝　陳　萍　王　昆　高　潔　孫立倩

(唐山市工人醫院神經外科，唐山063000)

[摘　要]　目的：觀察雌激素對蛛網膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)大鼠皮層P2X7受體(P2X7 receptor，P2X7R)表達及神經炎癥反應的影響。方法：采用改良血管內穿刺法建立SAH大鼠模型。將60只成年雄性SD大鼠隨機分為假手術組(Sham組)、模型組(SAH組)、雌激素治療組。通過激光多普勒血流儀檢測大鼠局部腦血流量； 采用ELISA法檢測大鼠腦皮層TNF-α、IL-6的表達水平；免疫組織化學及Western blot法檢測大鼠腦皮層中P2X7R的表達。結果：與Sham組相比，SAH后大鼠局部腦血流量顯著降低(P<0.05)；各時間點大鼠皮層內炎癥因子TNF-α、IL-6的含量明顯增多(P<0.05)，且于24 h達高峰；P2X7R蛋白表達量于6、12、24 h顯著上調(P<0.05)，且于12 h達峰值。與SAH組相比，雌激素組大鼠局部腦血流量明顯升高(P<0.05)；TNF-α、IL-6的含量及P2X7R蛋白量顯著降低(P<0.05)。結論：雌激素可以減輕蛛網膜下腔出血后腦皮層的神經炎癥反應，其機制可能與下調P2X7R蛋白相關。

[關鍵詞]　雌激素；蛛網膜下腔出血；神經炎癥；P2X7R

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.007

雌激素對蛛網膜下腔出血后P2X7受體及神經炎癥反應的影響

徐曉雨陳輝陳萍王昆高潔孫立倩

(唐山市工人醫院神經外科，唐山063000)

[摘要]目的：觀察雌激素對蛛網膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)大鼠皮層P2X7受體(P2X7 receptor，P2X7R)表達及神經炎癥反應的影響。方法：采用改良血管內穿刺法建立SAH大鼠模型。將60只成年雄性SD大鼠隨機分為假手術組(Sham組)、模型組(SAH組)、雌激素治療組。通過激光多普勒血流儀檢測大鼠局部腦血流量； 采用ELISA法檢測大鼠腦皮層TNF-α、IL-6的表達水平；免疫組織化學及Western blot法檢測大鼠腦皮層中P2X7R的表達。結果：與Sham組相比，SAH后大鼠局部腦血流量顯著降低(P<0.05)；各時間點大鼠皮層內炎癥因子TNF-α、IL-6的含量明顯增多(P<0.05)，且于24 h達高峰；P2X7R蛋白表達量于6、12、24 h顯著上調(P<0.05)，且于12 h達峰值。與SAH組相比，雌激素組大鼠局部腦血流量明顯升高(P<0.05)；TNF-α、IL-6的含量及P2X7R蛋白量顯著降低(P<0.05)。結論：雌激素可以減輕蛛網膜下腔出血后腦皮層的神經炎癥反應，其機制可能與下調P2X7R蛋白相關。

[關鍵詞]雌激素；蛛網膜下腔出血；神經炎癥；P2X7R

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.007

中圖分類號R743.35

文獻標志碼碼A

文章編號號1000-484X(2015)11-1472-04

作者簡介：徐曉雨(1973年-)，女， 主要從事顱內動脈瘤及SAH機制及防治方面的研究，E-mail:xuxiaoyu1973@163.com。

通訊作者及指導教師：孫立倩(1972年-)，男，博士，主任醫師，教授，主要從事顱內動脈瘤及SAH機制及防治方面的研究，E-mail:slq20000@126.com。

[Abstract]Objective:To investigate the effect of estrogen on the expression of P2X7 receptor (P2X7R) in the cerebral cortex and neuroinflammation after subarachnoid hemorrhage (SAH) in rats.Methods: The rat model of SAH was induced by modified monofilament puncture method.Sixty male SD rats were divided randomly into three groups：sham group；SAH group and estrogen-treatment group.The local cerebral blood flow was detected with laser doppler blood flow meter.The content of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) were measured by ELISA analysis.The expression of P2X7R in the cerebral cortex was tested by immunohistochemical and Western blot methods.Results: Compared with that in Sham group,cerebral blood flow was significantly decreased after SAH (P<0.05),the content of TNF-α and IL-6 in the cerebral cortex were significantly up-regulated at each time point after SAH (P<0.05),peaked at 24 h,and the expression of P2X7R significantly increased at 6 h,12 h and 24 h after SAH (P<0.05),peaked at 12 h.Compared with that in SAH group,cerebral blood flow was significantly increased in estrogen-treatment group (P<0.05),the levels of TNF-α,IL-6 and P2X7R were down-regulated in estrogen-treatment group (P<0.05).Conclusion: Estrogen could attenuate neuroinflammation in the cerebral cortex after subarachnoid hemorrhage in rats,which may be associated with the down-regulation in P2X7R proteins.

Effects of estrogen on expression of P2X7 receptor and neuroinflammation after subarachnoid hemorrhage in rats

XUXiao-Yu,CHENHui,CHENPing,WANGKun,GAOJie,SUNLi-Qian.DepartmentofNeurosurgery，TangshanWorkers’Hospital，Tangshan063000，China

[Key words]Estrogen;Subarachnoid hemorrhage;Neuroinflammation;P2X7R

蛛網膜下腔出血(SAH)是一種臨床常見的急危重癥腦血管疾病，具有較高的病死率和致殘率[1]。近50%SAH幸存者遺留有神經功能障礙，其中遲發缺血性神經功能障礙是最嚴重的并發癥[2]。臨床中顱內動脈瘤破裂是SAH發病的首要原因之一。SAH的病情較為復雜，目前發病機制尚不清楚，且欠缺有效的治療措施。近年來研究發現，雌激素(Estrogen)除在生殖系統中發揮功能外，在神經系統中的作用也開始備受關注。據文獻報道雌激素在阿爾茲海默病(Alzheimer’S disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、抑郁癥等神經系統疾病中發揮重要的腦保護作用[3]。本研究旨在從神經炎癥的角度探討雌激素對SAH的神經保護作用，以及其改善神經損傷的分子機理，為SAH的基礎研究提供理論依據，并為臨床SAH的藥物治療提供新的方向。

1材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑SPF級成年SD大鼠60只，雄性，體重300～320 g，由天津市山川紅實驗動物科技有限公司提供，無特定病原菌(SPF)環境飼養1周開始實驗。雌激素購自上海Westang公司；兔抗P2X7R多克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體均購自美國Abcom公司；TNF-α和IL-6的ELISA檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.2動物分組與模型建立60只成年雄性SD大鼠被隨機分為假手術組，SAH組，雌激素治療組，每組20只。每組再為6、12、24及72 h四個亞相，每個亞組5只。本實驗采用改良血管內穿刺法建立SAH大鼠模型[4]。大鼠給予10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉成功后，仰臥固定于手術臺上，頸部正中切口，暴露并剝離右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈。結扎并剪斷頸外動脈遠心端，形成約2 cm的殘端，同時夾閉頸總動脈和頸內動脈。在頸外動脈剪一小切口，將單絲尼龍線從小切口沿頸外動脈反向輕輕插入頸內動脈，其頭端距頸總動脈分叉處大約19 mm稍感阻力時，繼續向內送入2 mm并刺破血管壁，退出尼龍線，結扎殘端并消毒縫合皮膚切口。Sham組大鼠僅將尼龍線頭端送至與模型組近似的位置，但不刺破動脈管壁。雌激素治療組大鼠于SAH模型成功后的5 min內腹腔注射雌激素，劑量為1 kg/mg。Sham組及SAH組在相同時間腹腔注射0.9%無菌氯化鈉溶液，按1 kg/mg的劑量。

1.3腦血流檢測各組大鼠經10 %水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉成功后，在動物前囟后及中線左側各3 mm處鉆一直徑約2 mm的小孔，在立體定位儀下將激光多普勒血流計探頭置于硬腦膜，監測各組各時間點大鼠的腦血流量改變。

1.4ELISA法檢測各組大鼠腦皮層中的TNF-α和IL-6的蛋白含量的測定采用ELISA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，用酶標儀檢測待測液中TNF-α和IL-6的蛋白含量。

1.5免疫組織化學法檢測腦組織灌注固定，石蠟包埋切片，切片常規脫蠟至水。0.01 mol/L枸櫞酸鹽微波修復1 min，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶15 min，5% BSA封閉液30 min，甩干后滴加兔抗P2X7R的多克隆抗體(稀釋度1∶100)，4℃孵育過夜。次日用0.01 mol/L 的PBS(pH=7.2)漂洗3次，5 min/次，滴加羊抗兔的辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育30 min，SABC液孵育40 min，DAB顯色3~5 min。終止反應后脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡觀察。

1.6Western blot法檢測稱量100 mg腦組織，放入1 ml RIPA裂解液中，組織勻漿器進行低溫勻漿，冰上靜置10 min，12 000 r/min離心15 min后留取上清。BCA法測定上清液蛋白濃度，蛋白變性后進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以干轉法將分離蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，電轉時間為50 min。5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，滴加兔抗P2X7R多克隆抗體(稀釋度1∶400)或兔抗β-actin單克隆抗體(稀釋度1∶500)，4℃孵育過夜。次日以TBST洗膜5次，5 min/次，滴加羊抗兔的二抗，室溫孵育2 h，以TBST洗膜5次，5 min/次，ECL顯色液進行曝光。Image J醫學圖像分析系統進行半定量分析，以β-actin作為內參計算蛋白相對表達水平。

2結果

2.1大鼠局部腦血流量檢測結果Sham組大鼠實驗前后的局部腦血流量相對平穩。SAH后大鼠局部腦血流量急劇降低，6 h 血流量達最低值，在后續72 h內均維持較低的水平，與Sham組對應時間點及實驗操作前相比，差異均具有統計學意義(P<0.05)。與SAH組對應時間點相比，雌激素治療組大鼠腦血流量顯著增多(表1)。

2.2腦皮層中TNF-α和IL-6的含量Sham組大鼠各時間點腦組織中TNF-α和IL-6的含量呈現基礎水平，維持正常生理活動。SAH組大鼠各時間點腦組織TNF-α和IL-6的含量比Sham組含量顯著升高(P<0.05)，在SAH后24 h出現含量高峰。與SAH組相應時間點相比，雌激素治療組大鼠腦組織TNF-α和IL-6的含量明顯降低(P<0.05)(表2、3)。

2.3腦皮層P2X7R的蛋白定位表達免疫組織化學染色發現，P2X7R免疫反應陽性細胞，細胞膜被染成棕褐色。Sham組大鼠腦皮層中P2X7R的表達較弱。SAH大鼠腦皮層中可見大量的P2X7R陽性細胞，胞膜呈現深棕褐色，且數量較多，呈現棕褐色的圓環狀或半月形。雌激素治療組大鼠腦皮層中的P2X7R陽性細胞的染色變淺，且數量減少。

表1　各組大鼠局部腦血流量的變化(±s,LDF unit)Tab.1　Local cerebral blood flow in each group(±s,LDF unit)

表1　各組大鼠局部腦血流量的變化(±s,LDF unit)Tab.1　Local cerebral blood flow in each group(±s,LDF unit)

GroupsPreoperationPostoperation6h12h24h72hSham815.24±30.14799.27±38.36804.86±42.23817.95±35.73808.41±42.92SAH809.87±35.32389.48±37.511)435.58±29.221)497.71±5.221)542.19±31.981)Estrogen820.19±29.05597.17±33.252)659.53±27.292)694.13±39.672)725.99±41.862)

Note：1)P<0.05,compared with Sham group or preoperation;2)P<0.05,compared with SAH group.

表2　各組大鼠腦皮層TNF-α的含量變化(±s，ng/L)Tab.2　Content of TNF-α of cerebral cortex in each group(±s，ng/L)

表2　各組大鼠腦皮層TNF-α的含量變化(±s，ng/L)Tab.2　Content of TNF-α of cerebral cortex in each group(±s，ng/L)

Groups6h12h24h48hSham40.14±4.5739.04±2.4342.33±4.6541.24±4.21SAH59.22±5.281)67.57±3.851)82.38±4.921)73.41±5.271)Estrogen47.29±4.642)52.35±4.532)64.28±3.432)57.29±5.092)

Note：1)P<0.05,compared with Sham group;2)P<0.05,compared with SAH group.

表3　各組大鼠腦皮層IL-6的含量變化(±s，ng/L)Tab.3　Content of IL-6 of cerebral cortex in each group(±s，ng/L)

表3　各組大鼠腦皮層IL-6的含量變化(±s，ng/L)Tab.3　Content of IL-6 of cerebral cortex in each group(±s，ng/L)

Groups6h12h24h48hSham32.04±2.9834.22±3.0832.37±3.3733.34±4.05SAH53.43±4.121)62.13±3.721)75.38±5.671)61.84±4.811)Estrogen39.66±3.522)46.49±5.072)59.11±4.462)43.28±5.242)

Note：1)P<0.05,compared with Sham group;2)P<0.05,compared with SAH group.

2.4腦皮層中P2X7R的蛋白定量表達Western blot檢測結果顯示：P2X7R為一種嘌呤受體，分子量為69 kD。Sham組大鼠腦皮層中有微量的P2X7R蛋白表達，且不隨時間改變。SAH后6 h大鼠腦皮層P2X7R的蛋白表達量上調，12 h至高峰，之后的72 h內仍然高表達，于6、12、24 h與Sham組相比差異有統計學意義(P<0.05)。與SAH組相比，雌激素治療組大鼠腦皮層P2X7R蛋白表達量下調，于6、12、24 h差異均有統計學意義(P<0.05，圖2)。

3討論

早期腦損傷是蛛網膜下腔出血后的主要病理生理改變，是影響患者致殘、致死等不良預后的重要因素，也是導致SAH高死亡率和高致殘率的主要原因[5]。據Kusaka等[6]報道早期腦損傷是指SAH后在72 h內腦組織發生的包括腦血流量減少、血腦屏障損傷、顱內壓增高、急性腦血管痙攣、腦水腫、炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡等一系列病理生理過程。

圖1　腦皮層中P2X7R的免疫組織化學染色(×400)Fig.1　Immunohistochemical stainning of P2X7R in cerebral cortex(× 400)Note: A.Sham group ;B.SAH group;C.Estrogen group.

圖2　腦皮層中P2X7R的Western blot結果Fig.2　Western blot results of P2X7R expression in cerebral cortexNote: *.P<0.05,compared with Sham group;#.P<0.05,compared with SAH group.

其中神經炎癥反應是SAH后早期腦損傷中的關鍵環節，與神經功能損傷的嚴重程度密切相關[7]。本實驗采用改良血管內穿刺法建立SAH大鼠模型，模擬SAH后的病理生理過程。通過ELISA法檢測SAH后72 h內腦皮質中TNF-α和IL-6含量，進而揭示SAH后早期腦損傷中的神經炎癥損傷程度及動態變化，發現SAH后6 h炎性因子顯著增多，于24 h含量達高峰，并且各時間點動物處死前監測局部腦血流變化發現：SAH后72 h內局部腦血流量明顯減少。有報道顯示SAH后外周血和腦脊液中多種炎性因子水平的升高與局部腦血流量的改變是相關的[8]。我們在SAH模型制備成功后給予雌激素治療，發現可明顯增加腦血流量，拮抗腦皮層的神經炎癥反應，減輕腦組織損傷程度。

本研究旨在探討雌激素對實驗性SAH早期腦損傷中的神經炎癥的影響及分子機制。雌激素屬于類固醇激素，具有脂溶性，可以透過血腦屏障。有研究證實，除了生殖器官外，腦也是雌激素作用的主要靶器官[9]。雌激素通過與靶器官中不同的雌激素受體亞型相結合而產生相應的生物學作用[10]。雌激素能通過與腦中相應受體結合，進而調節突觸可塑性、促進海馬CA1區神經元軸突生長，上調腦源性神經營養因子的表達[11]。肖麗等[12]在腦卒中后抑郁大鼠模型中，發現生理劑量雌激素可增加側腦室室下區神經元的再生，并且能夠改善大鼠的抑郁癥狀。越來越多的證據已經證實雌激素具有神經保護作用，然而這種保護性療效是否與神經炎癥反應相關及其機制尚有待研究。本研究發現SAH模型成功后5 min腹腔注射雌激素，可以明顯減輕腦組織內炎癥因子的表達，增加局部腦血流量，促進早期腦損傷的恢復。這些揭示雌激素可通過抑制SAH后早期腦損傷病理過程中的神經炎癥反應，發揮一定的腦保護作用。然而本實驗進一步探討了雌激素在SAH中抗炎癥損傷的分子機理。

P2X7R是一種嘌呤受體，一種感受ATP刺激的配體門控的離子通道，開放可以選擇性通過Na+、K+、Ca2+等陽離子。P2X7R主要表達在免疫細胞和上皮細胞中，起到免疫調控的作用。在中樞神經系統中，P2X7R主要表達在小膠質細胞，而在星形膠質細胞，少突膠質及神經元中的表達尚存在爭議[13]。P2X7R對ATP的敏感性較低，可被較高濃度的ATP刺激(>100 μmol/L)導致細胞膜孔道形成，激活小膠質細胞進而釋放TNF-α、IL-6及IL-1β等一系列前炎癥因子[14]。應用P2X7R阻斷劑可以減輕這些前炎癥因子的釋放及其所誘導的炎癥反應。文獻報道P2X7R參與了包括腦缺血再灌注損傷、AD、脊髓損傷和癲癇等多種中樞神經系統疾病的病理生理過程[15]。基于P2X7R獨特的結構和功能特點，本研究探討了雌激素是否可通過抑制SAH后腦組織P2X7R的表達調控神經炎癥反應。免疫組化及免疫印跡結果顯示：P2X7R在SAH大鼠的早期腦損傷過程中呈現持續的高表達，在12 h蛋白表達量達高峰，給予雌激素治療后大鼠腦組織中的P2X7R明顯下調。所以推斷SAH發生后，腦組織損傷導致大量的ATP釋放，持續高濃度ATP微環境刺激，誘導小膠質細胞上P2X7R的激活，進而釋放大量炎癥因子。雌激素治療可以下調SAH后腦組織P2X7R的表達，進而減輕神經炎癥反應，促進腦損傷的恢復。然而此過程中涉及的具體分子信號轉導通路尚不清楚，有待繼續深入探討。

本實驗揭示雌激素可以通過下調SAH后腦組織中P2X7R的蛋白表達量，進而減輕神經炎癥因子的表達和釋放，增加局部腦血流量，最終促進腦損傷的恢復，在SAH治療中發揮一定的神經保護作用。

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[收稿2015-04-19修回2015-07-06]

(編輯許四平)