根皮苷對LO2正常人肝細胞體外細胞毒性的實驗研究

根皮苷對LO2正常人肝細胞體外細胞毒性的實驗研究

陳署賢1,郭建茹2,朱冬梅3,劉華楨3,林繼宗1,侯少貞3*

(1.中山大學附屬第三醫院肝病外科，廣州 510630；2.澳門科技大學中藥質量研究國家重點實驗室，澳門 999078；

3.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 510006)

摘要：目的探究根皮苷對正常人肝細胞LO2的體外細胞毒性。方法實驗分為正常組和根皮苷組。將從甜茶中提取根皮苷配以不同濃度根皮苷的培養液，濃度分別為4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128、256、512、800、1 000 μmol/L。分別在24、48和72 h，使用MTT比色法測定并計算出細胞活力率。結果給藥24、48和72 h后，根皮苷在4.0～1 000 μmol/L濃度的范圍內對正常人肝細胞LO2無毒性作用，細胞的存活率在90%以上。結論在4.0～1 000 μmol/L濃度范圍內，根皮苷對正常人肝細胞的正常增殖無明顯抑制，未顯示有肝細胞毒性作用。

關鍵詞：根皮苷；肝細胞；MTT

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.11.024

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

基金項目:國家自然科學基金(81303281)；廣東省教育部產學研結合項目(2012B091100184)；廣州中醫藥大學優秀青年學者科研基金項目(2012)。

作者簡介:陳署賢(1981-)，男，碩士研究生，主治醫師，主要從事脂肪肝的發展機制及治療研究。

收稿日期:(責任編輯：張瑞彬2014-11-07)

*通信作者:侯少貞,電子信箱-hsz0214@gzucm.edu.cn

Cytocoxicity of Phloridzin on LO2 human liver cells

CHEN Shuxian1,GUO Jianru2,ZHU Dongmei3,LIU Huazhen3,LIN Jizong1,HOU Shaozhen3*

(1.Department of Hepatobiliary Surgery,The Third Affiliated Hospital of SUN YAT-SEN University,Guangzhou 510630,China;

2.State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine,Macau University of Science

and Technology,Macau 999078,China;

3.College of traditional Chinese Medicine,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the cytotoxicity of Phloridzin on LO2 human liver cells.MethodsThe normal group and Phlorizin groups with the concentrations of 4.0,8.0,16.0,32.0,64.0,128,256,512,800,1 000 μmol/L were established.Then the rate of cell viability was calculated by the MTT assay,respectively at 24 h,48 h and 72 h after administration.ResultsAfter administration for 24,48 and 72 hours,the absorbance of all Phlorizin groups were similar to that of normal group,and there were no statistical significance.The cell viability was all above 90%.ConclusionPhlorizin has no toxicity to normal human liver cells with the concentration range of 4.0-1 000 μmol/L.

Keywords:Phloridzin;LO2 human liver cells;MTT assay

根皮苷最早是從蘋果、蘋果樹皮及葉中提取而得，屬于二氫查耳酮化合物[1]。同時，根皮苷還廣泛存在于多穗柯植物的葉中[2]。多穗柯，俗稱“甜茶”，是南方地區一種作為保健茶的中藥，其功效主要有清熱解毒、滋肝補腎、生津潤肺等，主要用于降低血糖、降血脂、降血壓等[3-4]?？紤]作為保健茶飲用，藥材主要活性成分的安全性研究是一項必要的工作。經口化合物進入腸道被人體吸收后，一般主要在肝臟代謝，由此最容易也最早產生肝毒性作用[5]。根皮苷是甜茶的主要化學成分，目前尚未有關于其對肝細胞毒性的實驗報道。本實驗擬初步考察根皮苷對肝細胞的毒性作用，為甜茶及根皮苷的食用和治療的安全性提供部分實驗依據。

1實驗材料

1.1細胞LO2細胞，為人肝細胞株，購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2藥物根皮苷(Phloridzin)，由廣州中醫藥大學新藥開發研究中心提供，經HPLC檢測結果顯示，根皮苷純度超過為96%。

1.3試劑及儀器改良型RPMI-1640培養基，Hyclone公司;青霉素-鏈霉素雙抗液，上?；鄯f生物科技有限公司;0.25%胰酶-EDTA，美國GIBCO公司；胎牛血清，美國GIBCO公司；MTT，Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)，天津市大茂化學試劑廠；CO-150型一氧化碳培養箱，美國NBS公司；SW-CJ-2F型醫用凈化工作臺，蘇州凈化設備廠；CKX-41-32型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；CU600型電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科學儀器有限公司；RT-2100C型酶標分析儀，深圳雷杜生命科學股份有限公司。

2實驗方法

2.1試劑配制

2.1.1MTT的配制用精密天平稱取0.25 g MTT，置于50 mL容量瓶中，加PBS適量，50～60 ℃水浴，搖勻使溶解充分，加PBS至刻度，配制成5 mg/kg的溶液，用0.22 μm的唯孔濾膜過濾除菌，分裝后避光4 ℃冰箱保存。

2.1.2細胞凍存液的配制細胞凍存液按照20%血清、10%DMSO、70%1640培養基混合均勻，-20℃保存。

2.1.3根皮苷的配制用DMSO配成藥物的母液，然后用培養液稀釋到所用藥物的濃度，DMSO的終濃度控制在≤0.1%。

2.2LO2細胞培養將人正常的LO2細胞放入25 cm2細胞培養瓶，加入含10%FBS的RPMI-1640培養液約4～5 mL，置37 ℃細胞培養箱中,5%CO2飽和濕度細胞培養箱中培養。每2 d換1次培養液，每天觀察細胞生長情況，細胞80%融合后進行傳代或凍存。取5～7代細胞用于正式試驗。

2.3分組與給藥實驗分為正常細胞對照組，根據預實驗結果設置不同濃度根皮苷給藥組，濃度分別為4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128、256、512、800、1 000 μmol/L。

2.4肝細胞MTT比色取對數生長期LO2細胞，配成5.0×103個/mL的細胞懸液接種于96孔板，設置正常對照組，不同濃度4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128、256、512、800、1 000 μmol/L的根皮苷給藥組。培養24 h后，吸棄培養液，用PBS洗2～3次,分別加入上述不同濃度的根皮苷，每個濃度設8個復孔，置37 ℃，5%CO2培養箱培養。培養24、48、72 h后，在各個時間段分別加入MTT溶液，避光培養4 h。4 h后，吸棄上層培養基，再每孔加入150 LDMSO溶劑溶解噻唑藍結晶，輕搖培養板使溶解均勻。酶標儀在490 nm處測定各孔吸光度值。每孔吸光值大小反應細胞數量的多少，兩者呈正比。實驗重復3次。

計算出細胞活力率:細胞活力率(%)=各組吸光度(OD490)×100/對照組吸光度(OD490)

3實驗結果

不同濃度根皮苷在不同時間段內對細胞生長的影響結果見表1～3。實驗數據結果顯示，給藥24 h后，不同濃度的根皮苷給藥組與正常組的OD值相比較無統計學意義，細胞的存活率跟正常組細胞接近；給藥48 h后，各組細胞OD值比24 h后的變大，提示細胞正常生長，不同濃度的根皮苷給藥組的細胞正常生長，存活率大于90%，與正常組相比較無統計學意義;給藥72 h后，各組細胞的OD值呈增長趨勢，但增長率減小，提示細胞仍處于生長階段，生長速度有所抑制。不同濃度的根皮苷給藥組對細胞無抑制作用，OD值跟正常組比較，也無統計學意義，細胞的存活率大于90%，可以認為根皮苷在4.0～1 000 μmol/L的范圍內，對細胞生長抑制不大，對細胞無毒性。

4討論

根皮苷是一種在蘋果樹、多穗柯及植物甜茶葉中普遍存在的天然產物和膳食成分[6-8]，它具有降低血糖、抗氧化、抗癌等多種生物活性[9-11]。由于根皮苷廣泛存在于藥品、保健品中，并且根皮苷已經批準成為食品添加劑，可以作為甜食愛好者和糖尿病人的糖類替代食品[7],因此考察根皮苷對肝細胞毒性具有實際意義。

表1　根皮苷作用24 h對LO2細胞生長的影響

表2　根皮苷作用48 h對LO2細胞生長的影響

表3　根皮苷作用72 h對LO2細胞生長的影響

體外細胞毒性實驗[13-14]是化學成分毒性研究的最常用方法之一，具有快捷、簡便、直觀的優勢。本實驗根據MTT比色法[15]的原理，測定根皮苷不同濃度對LO2細胞生長情況的影響，觀察到根皮苷作用不同時間(24、48、72 h)對LO2細胞增殖是否有抑制作用。本研究發現根皮苷在4.0～1 000 μmol/L的范圍內。正常對照組的細胞在48、72 h的時間段內增長率相近,細胞在72 h內呈正常生長狀態。根皮苷給藥組在用藥干預48 h后各組細胞增長率比給藥72 h后大；給藥干預72 h后各組細胞的OD值呈增長趨勢，但增長率減小，提示細胞仍處于生長階段，而藥物在給藥72 h后對細胞生長速度有所抑制，但無統計學意義。因此可以說根皮苷對肝細胞生長抑制不大，對肝細胞未顯示明顯毒性。

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