離子色譜法測(cè)定煙葉中游離氨基酸

李輝 岳先領(lǐng) 李皓 侯鵬娟 張峻松

摘要：為了研究離子色譜法測(cè)定煙葉中游離氨基酸含量，以游離氨基酸測(cè)定總量為指標(biāo)，考察了萃取所用的溶劑、溫度、時(shí)間以及料液比等因素對(duì)游離氨基酸測(cè)定量的影響。結(jié)果表明，煙草中游離氨基酸的最優(yōu)檢測(cè)條件為：萃取溶劑為0.1 mol/L鹽酸、萃取時(shí)間為30 min、萃取溫度為30 ℃、煙葉與鹽酸的比例為1∶40（w/v）。測(cè)定方法的氨基酸檢出限為2.76～22.36 ng/mL，定量限為9.57～102.13 ng/mL，試驗(yàn)的RSD為1.26%～4.96%，氨基酸的加標(biāo)回收率為83.51%～106.78%，說(shuō)明該優(yōu)化方法可行，利用確定的最佳條件測(cè)定了國(guó)內(nèi)主產(chǎn)區(qū)的10種烤煙型煙葉。

關(guān)鍵詞：煙草;游離氨基酸;離子色譜;測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)：O656.3 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）23-6023-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.058

Determination of Free Amino Acids in Tobacco by Ion Chromatography Method

LI Hui1，YUE Xian-ling1，LI Hao2，HOU Peng-juan2，ZHANG Jun-song2

（1.Technology Center of Heilongjiang Tobacco Industry Co.，Ltd.， Harbin 150001， China;

2.College of Food and Bioengineering Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002， China）

Abstract： In order to study the effect of ion chromatography method for the determination of free amino acids in tobacco， the optimization of the experimental conditions were studied， the value of free amino acids used as a response value. The experimental results showed that the best experimental conditions were as follows： the extract solvent was 0.1 mol/L hydrochloric acid; the temperature of experiment was 30 ℃; the extract time was 30 min; the solid to liquid ratio was 1∶40（w/v）. The detection limit of the method was 2.76～22.36 ng/mL，limit of quantitation was 9.57～102.13 ng/mL， the method has high recovery（83.51%～106.78%）and good repeatability （RSD<5%）， these results demonstrate that this method is feasible. The contents of free amino acids in 10 flue-cured tobaccos were determined.

Key words：tobacco;free amino acids;ion chromatography;determination

游離氨基酸是煙草中的一類(lèi)重要化合物，約占煙葉重量的0.5%～2.1%[1]，在煙草生長(zhǎng)、烘烤、陳化、工藝加工以及燃燒的過(guò)程中參與化學(xué)反應(yīng)，并生成許多種具有不同香味特征的化合物，與煙葉內(nèi)或外加的還原糖發(fā)生縮合以及縮合物的進(jìn)一步降解，生成一系列的吡咯、吡嗪和呋喃類(lèi)等堿性香味化合物，這些堿性香味成分對(duì)煙草的香氣、吸味等感官質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響[2，3]。某些氨基酸也可以自身分解，生成具有香味的化合物，因此煙葉中游離氨基酸的種類(lèi)數(shù)量以及煙葉中各種氨基酸的含量的多少與煙葉品質(zhì)的好壞有著重要的相關(guān)性[4，5]。

研究發(fā)現(xiàn)，煙葉中適量的氨基酸可有助于提高相應(yīng)卷煙煙氣勁頭以及增加其煙氣的豐滿(mǎn)度，但是若煙葉中氨基酸含量過(guò)于偏高，會(huì)使相應(yīng)卷煙煙氣產(chǎn)生過(guò)于辛辣的口感，并且味苦、刺激性強(qiáng)烈，含量過(guò)低則會(huì)使煙氣趨于平淡無(wú)味，豐滿(mǎn)程度變差，因此煙草中氨基酸含量的多少對(duì)其感官質(zhì)量有重要的影響[6-8]。為此利用離子色譜測(cè)定煙草中游離氨基酸，以期為卷煙工業(yè)合理利用煙葉原料提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與儀器

試驗(yàn)所用煙葉均為黑龍江煙草工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供;17種氨基酸標(biāo)樣（>99%，百靈威公司）;無(wú)水醋酸鈉（>99.9%， Dionex公司）;氫氧化鈉和氨水（AR，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）;37%鹽酸（ACROS公司）;SPE SCX 4 mL/200 mg強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取小柱;0.45 μm水相濾膜（津騰）。

HZ-F185型旋轉(zhuǎn)恒溫震蕩器（太倉(cāng)試驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)）;ICS-5000+型分析型多功能離子色譜（美國(guó)戴安公司）;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?煙葉樣品的制備

根據(jù)中國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9]，對(duì)煙葉樣品進(jìn)行了制備，并根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其含水量進(jìn)行測(cè)定。將煙葉自然風(fēng)干后粉碎，過(guò)0.5 mm篩網(wǎng)后置于廣口瓶中保存。

1.2.2 ?氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2.5 μmol/mL）用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取賴(lài)氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸、谷氨酸、胱氨酸、絲氨酸、脯氨酸、組氨酸、亮氨酸、天冬氨酸和酪氨酸等樣品（精確至0.1 mg）置于小燒杯中，加入少許0.1 mol/L鹽酸使其完全溶解，然后將燒杯中的混合氨基酸溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，用0.1 mol/L稀鹽酸定容至刻度線(xiàn)，即配成混合氨基酸儲(chǔ)備液，其濃度為2.5 μmol/mL。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用鹽酸萃取溶劑對(duì)上述配置好的17種2.5 μmol/mL的氨基酸儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)玫降臉?biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為4、20、50、125、250、2 500 nmol/mL。

1.2.3 ?煙葉樣品的前處理方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g煙草粉末樣品（精確至0.1 mg）置于100 mL錐形瓶中，加入一定體積鹽酸提取溶液，具塞后放置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩萃取，震蕩完成后將萃取液經(jīng)濾紙過(guò)濾，除去煙草樣品粉末，再準(zhǔn)確移取2 mL濾液，混合均勻，離心30 min，然后過(guò)陽(yáng)離子固相萃取小柱，對(duì)萃取溶液進(jìn)行純化。

1.3 ?離子色譜分析條件

色譜柱：氨基酸陰離子交換柱（250 mm×2 mm）;柱溫為32 ℃;流速為0.25 mL/min;進(jìn)樣量為25 μL;

流動(dòng)相A為水;流動(dòng)相B為250 mmol/L氫氧化鈉溶液;流動(dòng)相C為1 mol/L醋酸鈉溶液;梯度洗脫程序如表1所示。

1.4 ?游離氨基酸的定性、定量方法

采用與標(biāo)準(zhǔn)樣品相對(duì)保留時(shí)間比較對(duì)各游離氨基酸進(jìn)行定性，采用外標(biāo)工作曲線(xiàn)法定量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?氨基酸的工作曲線(xiàn)

對(duì)上述所制得的17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用離子色譜脈沖安培法進(jìn)行測(cè)定，分別得到不同種類(lèi)氨基酸相應(yīng)的積分峰面積，然后以不同種類(lèi)氨基酸相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y），以17種氨基酸的濃度為橫坐標(biāo)（x）建立校正曲線(xiàn)。得到各游離氨基酸線(xiàn)性方程及相關(guān)系數(shù)，各成分的R2為0.995 2～0.999 9，表明工作曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好，適用于游離氨基酸的定量計(jì)算。

2.2 ?試驗(yàn)條件對(duì)氨基酸測(cè)定結(jié)果的影響

2.2.1 ?萃取溶劑對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

大部分的氨基酸可在水中溶解，僅有幾種在水中的溶解度稍差，可用稀鹽酸溶液振搖萃取。因此對(duì)煙葉中氨基酸的萃取采用稀鹽酸溶液，分別選用0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mol/L鹽酸溶液和0.1 mol/L的鹽酸-乙醇溶液（50∶50，V/V），結(jié)果表明，0.1 mol/L的鹽酸-乙醇（50∶70，V/V）萃取溶液由于含有一定量的乙醇，而乙醇在脈沖安培檢測(cè)器上有一定的響應(yīng)值，從而干擾氨基酸的定量檢測(cè)結(jié)果;利用不同濃度的鹽酸溶液對(duì)煙草樣品中的游離氨基酸的萃取效果有較大影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著鹽酸濃度的增加煙葉中游離氨基酸總量測(cè)定值也隨之增加，當(dāng)鹽酸溶液濃度大于0.08 mol/L時(shí)，萃取煙草和煙草樣品中游離氨基酸的穩(wěn)定性和萃取效率均好，當(dāng)濃度達(dá)到0.10 mol/L時(shí)游離氨基酸總量最大，因此從萃取效率和穩(wěn)定性最佳角度考慮，試驗(yàn)選擇0.10 mol/L鹽酸溶液作為萃取溶劑。

2.2.2 ?萃取時(shí)間對(duì)氨基酸測(cè)定結(jié)果的影響

為選擇合適的萃取時(shí)間，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g煙末樣品，保持其他測(cè)試條件不變，分別選擇振蕩萃取為5、10、20、30、40、50 min進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著萃取時(shí)間的增加，在20 min之前游離氨基酸總量測(cè)定值也隨之增加，在20 min以后萃取時(shí)間對(duì)萃取的效率影響不大，由于考慮到不同的煙葉樣品之間存在差異性，本試驗(yàn)選擇游離氨基酸的最佳萃取時(shí)間為30 min。

2.2.3 ?萃取溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

為選擇合適的萃取溫度，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g樣品各6份，保持其他條件不變，分別設(shè)定萃取溫度為20、25、30、35和40 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著萃取溫度的升高游離氨基酸的測(cè)定值也隨之增加，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)測(cè)定值達(dá)到最大，之后游離氨基酸的總量有所下降。主要原因是隨著溫度的增加會(huì)促進(jìn)煙葉的美拉德反應(yīng)，而導(dǎo)致氨基酸的測(cè)定結(jié)果偏低。

2.2.4 ?料液比對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

為選擇合適的料液比，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g樣品各6份，保持其他因素不變，分別選取煙末和0.10 mol/L鹽酸的比例為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（w/v）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。

由圖4所知，隨著料液比的升高游離氨基酸的測(cè)定值也隨之增加，當(dāng)料液比為1∶40（w/v）時(shí)測(cè)定值達(dá)到最大，之后游離氨基酸測(cè)定值有所下降。主要原因是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)高級(jí)脂肪酸會(huì)破壞，導(dǎo)致測(cè)定值偏低。

2.3 ?方法的檢測(cè)限

本試驗(yàn)選取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的最低濃度進(jìn)行連續(xù)重復(fù)10次進(jìn)樣，將10次進(jìn)樣測(cè)定結(jié)果的峰面積代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，再對(duì)其10次測(cè)定計(jì)算得出的濃度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）的計(jì)算，分別以3倍標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)偏差和10倍標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得到的值為本方法的檢出限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 ?方法的重復(fù)性

試驗(yàn)選擇同一煙末樣品，按照前述優(yōu)化后的方法進(jìn)行6次平行前處理，結(jié)果表明各游離氨基酸的RSD為4.96%～1.26%，表明該方法的重復(fù)性較好，可滿(mǎn)足氨基酸的定量分析。

2.5 ?樣品的加樣回收率

選用標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)樣本進(jìn)行不同濃度水平的加標(biāo)后，依照前面所確定的前處理方法，最終根據(jù)加標(biāo)回收試驗(yàn)計(jì)算其加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率為83.51%～106.78%，滿(mǎn)足定量分析要求。

2.6 ?樣品的測(cè)定結(jié)果

利用優(yōu)化后的離子色譜法測(cè)定游離氨基酸的試驗(yàn)條件，分別對(duì)國(guó)內(nèi)云南、河南、四川、貴州等10個(gè)烤煙型葉中的游離氨基酸進(jìn)行了測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，在所分析的煙葉中，氨基酸總量分布范圍為8.75～15.35 mg/g，其中煙葉中所含脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的含量相對(duì)較高。

3 ?小結(jié)與討論

1）以游離氨基酸總量為考察指標(biāo)，明確了離子色譜法測(cè)定煙草中游離氨基酸的最優(yōu)試驗(yàn)條件為：萃取用溶劑為0.10 mol/L的鹽酸、萃取時(shí)間為30 min、萃取溫度為30 ℃、煙葉于鹽酸的比例為1∶40。

2）對(duì)試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，測(cè)定方法的氨基酸檢出限為2.76～22.36 ng/mL，定量限為9.57～102.13 ng/mL，試驗(yàn)的RSD為1.26%～4.96%，氨基酸的加標(biāo)回收率為83.51%～106.78%，說(shuō)明該方法可滿(mǎn)足對(duì)煙葉中游離氨基酸的分析，并利用該方法對(duì)國(guó)內(nèi)主產(chǎn)區(qū)的10種煙葉中的游離氨基酸進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，煙葉中所含脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等氨基酸含量較高。

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