云南省馬鈴薯脫毒試管苗和微型薯病毒檢測與分析

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云南省馬鈴薯脫毒試管苗和微型薯病毒檢測與分析

張麗珍，董家紅*，鄭寬瑜，吳闊，蘇曉霞，方琦，張仲凱*

（云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南省農業生物技術重點實驗室，農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南昆明650223 )

摘要：病毒病是制約馬鈴薯產量和質量的重要因素。馬鈴薯脫毒試管苗、微型薯是生產脫毒種薯的重要環節。本研究于2010~2013年對收集自云南省的試管苗274個、微型薯356個，共計630個樣品。應用電子顯微鏡觀察，并采用DAS-ELISA檢測了8種病毒：馬鈴薯S病毒、馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯M病毒、番茄斑萎病毒和煙草環斑病毒，發現試管苗和微型薯中馬鈴薯S病毒檢出率最高（21.27%），其次是PLRV(5.71%)；還檢測到了新出現的侵染馬鈴薯的番茄斑萎病毒和煙草環斑病毒。研究結果為馬鈴薯種薯生產過程中病毒病的檢測防控提供了參考。

關鍵詞：試管苗；微型薯；脫毒種薯；主要病毒；檢出率；分析

馬鈴薯是云南省的優勢農作物，是云南發展高原特色農業打造的“十二大品牌”之一，2012年總種植面積58.6萬hm2，總產量842.5萬t，但平均單產14.38 t/hm2，遠遠低于世界上最高的國家荷蘭的平均單產（50 t/hm2）水平，也低于全國平均水平（22.5t/hm2）。

馬鈴薯以營養體為繁殖材料，容易被病毒感染，并傳播擴散到子代，造成病害逐年嚴重，產量逐年降低，種薯種質嚴重退化[1]。目前報道感染危害馬鈴薯的病毒有40余種，且不斷有新病害發生[2,3]。近年來在中國影響馬鈴薯產業比較嚴重的主要有馬鈴薯X病毒（Potato virus X, PVX）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）、馬鈴薯S病毒（Potato virus S, PVS）、馬鈴薯A病毒（Potato virus A, PVA）、馬鈴薯M病毒（Potato virus M, PVM）以及馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus, PLRV）[3-6]。在缺乏抗性品種以及沒有有效的病毒病防治藥劑的情況下，目前最有效的防控馬鈴薯病毒病害的措施就是使用脫毒馬鈴薯。所以，在馬鈴薯生產中，優質的脫毒種薯是提高馬鈴薯產量和質量的保障。

自20世紀80年代末期以來，為解決生產中馬鈴薯種薯的退化問題，云南省開始研究、推廣脫毒種薯，建立脫毒種薯生產體系及種薯質量監督檢測體系[6]。但在實際生產過程中，由于各種薯生產單位技術水平參差不齊，尤其是缺少對種薯質量的檢測能力，致使生產的種薯帶毒率較高。生產上缺乏合格的脫毒種薯是限制云南省馬鈴薯產業發展的瓶頸問題。脫毒種薯生產的核心環節首先要保證脫毒試管苗的帶毒率為零，所以摸清各種薯生產單位脫毒試管苗以及微型薯的帶毒情況，是生產健康優質的馬鈴薯種薯的重要保障。本研究對云南省種薯生產單位的試管苗、微型薯進行了抽樣，通過電子顯微鏡負染色初步觀察，然后用酶聯免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測了云南省馬鈴薯脫毒試管苗和微型薯。檢測結果有利于掌握云南省馬鈴薯種薯質量及病毒病發生情況，對馬鈴薯種薯生產過程中的病毒檢測和防控具有指導意義。

1　材料與方法

1.1樣品來源

2010~2013年，對云南省昆明、曲靖、昭通、麗江、迪慶、楚雄、大理等地州市的馬鈴薯生產單位和公司的馬鈴薯試管苗、微型薯進行病毒檢測，品種主要為當地主栽品種‘合作88’、‘會-2號’、‘大西洋’、‘麗薯6號’、‘宣薯2號’、‘費烏瑞它’等。試管苗樣品采用隨機抽取，取自昆明、麗江、昭通、曲靖。微型薯樣品取自昆明、曲靖、昭通、麗江、迪慶、楚雄和大理，有花葉、黃化、矮化、卷葉和壞死等病毒癥狀的樣品，顯示明顯癥狀的樣品取單個樣品檢測，無明顯病毒病癥狀的隨機取樣，每地塊隨機取5點，每點取5株，催芽后各取一個芽眼混為1個樣。所采集的樣品有馬鈴薯脫毒試管苗274株，微型薯356株。

1.2方法

1.2.1電子顯微鏡負染色方法

取試管苗、薯塊芽組織，加入等體積的ddH2O后，用刀片均勻切至植物粗汁液溢出，用Formvar膜覆蓋的銅網蘸取粗汁液，用2%鉬酸銨負染色，置于JEM100CX-Ⅱ型透射電鏡下觀察病毒粒體形態特征[7]。

1.2.2ELISA方法

針對馬鈴薯主要病毒PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA和PVM進行DAS-ELISA檢測，部分樣品根據電子顯微鏡負染色觀測結果還檢測了番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）、煙草環斑病毒（Tobacco ringspot virus, TRSV）。馬鈴薯病毒檢測試劑盒購自美國Agdia公司，按照說明書進行檢測。

2　結果與分析

2.1電鏡觀察結果與分析

對于試管苗，全部制樣觀察，而微型薯，同一批次的樣品隨機取5個薯塊催芽后取芽眼制樣。觀察結果發現20%以上的樣品能觀察到典型的病毒粒體，病毒粒體形態主要有如下4種：輕微彎曲線狀粒體，大小為515 nm×13 nm，初步判斷為PVX；等軸球狀粒體，直徑約30~40 nm，初步判斷主要為PLRV，其次可能是TRSV；剛直線狀粒體，大小為650 nm×12 nm，初步判斷為PVS；彎曲線狀的粒體，大小為760 nm×11 nm，初步判斷主要為PVY；部分樣品為被膜的球形病毒粒體，直徑為80~85 nm，初步判斷為番茄斑萎病毒屬病毒。

2.2ELISA檢測結果與分析

檢測試管苗274份樣品，總病毒檢出率為24.08%，檢測到了PVX、PVS、PVY、PVA、PLRV、TSWV，沒有檢測到PVM。TSWV從昆明的樣品檢出，而其它地方的試管苗沒有檢測到。其中檢測率最高的為PVS，檢出率為14.60%，其次為PLRV，檢出率為4.74%。昆明樣品中有3個樣品分別為PVY/PVS、PVA/PLRV、PVX/PVS/PLRV復合侵染，其余樣品沒有檢測到復合侵染情況（表1）。

表1　試管苗病毒檢測Table 1 Virus detection of invitroplantlets

檢測微型薯356個樣品，總病毒檢出率為35.11%，檢測到了PVX、PVS、PVY、PVA、PLRV、TSWV、PVM，與試管苗一樣僅從昆明樣品中檢測到了TSWV，昆明的1個樣品中檢測到TRSV。檢測率最高的2個病毒仍是PVS和PLRV，檢出率分別為26.40%和6.46%。檢測到10個樣品為復合侵染，主要是PVS/PLRV復合侵染（表2）。

表2　微型薯病毒檢測結果Table 2 Virus detection of minitubers

3　討論

自2010~2013年來，檢測云南省各地的274個試管苗和356個微型薯，共計630個樣品，檢出率最高的兩個病毒是PVS和PLRV，檢出率分別為21.27%和5.71%，這與張仲凱等[6]2003年報道的主要優勢病毒PVX、PVY和PLRV有所不同，但病毒種類變化不大。白艷菊等[8]對2004～2005年云南省的2個試管苗樣品和28個原原種樣品檢測結果，試管苗帶毒率100%，原原種帶毒率64.28%，主要是PVS和PVY，復合侵染嚴重。本研究結果與白艷菊等[8]報道的結果相比，檢出率有所減低，復合侵染情況也明顯減少，雖然當前云南省種薯質量較2005年前得到了明顯改善，但整個現狀仍然令人堪憂。

本研究發現，PVS在試管苗和原原種微型薯檢出率均最高，分別檢到了14.60%和26.40%，結果與范國權等[9]自2004～2010年對全國馬鈴薯病毒病跟蹤調查相比發現，整體病毒檢出率呈下降趨勢，但試管苗中PVS病毒檢出率仍然是最高。高艷玲等[10]對黑龍江、內蒙古、甘肅、貴州等幾個馬鈴薯種植大省的試管苗、原原種和大田樣品檢測發現，檢出率最高的病毒仍然為PVS，檢出率18.94%。PVS檢出率較高，可能與該病毒較難脫除有關，需要進一步研究脫除PVS的脫毒技術。

昆明地區的試管苗和微型薯均檢測到了TSWV，TSWV是近年在云南省的番茄、煙草上危害較重的病毒，馬鈴薯是TSWV寄主之一，主要由西花薊馬（Frankliniella occidentalis）傳播[11]，在一些送檢試管苗樣品中以及微型薯實地調查觀察到了大量薊馬，從這些樣品中檢測到了TSWV。昆明的1個樣品檢測到了TRSV。PVA、TSWV、TRSV屬于檢疫性有害生物，應防止其傳播擴散的風險。PVM僅檢測到一個樣品，但仍然值得重視。

國標（GB 18133-2012）規定用于馬鈴薯各級別種薯的田間檢測質量要求，二級種的總病毒允許率最高為10%，根據結果可知云南省試管苗的合格率為75.92%，微型薯為64.89%，與國標要求差距較遠。核心因素是種薯生產體系不規范，質量監督檢測體系不健全，種薯生產環節與質量監督檢測嚴重脫節。云南省種薯生產單位普遍缺少檢測所需設備和技術人員，在種薯生產的整個過程中沒有按國標或地標進行檢測，長期以往造成普遍認為只要通過莖尖剝離即能完成脫毒。近年來云南省通過現代農業馬鈴薯產業技術體系的建立，在馬鈴薯生產的各個環節取得了顯著成效，尤其在提高種薯生產單位檢測意識，提升質量檢測技術部門檢測能力方面得到了明顯改善，對提高云南省脫毒種薯質量有積極的意義。

[參考文獻]

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Virus Detection and Analysis of in vitro Plantlets and Minitubers of Virus-free Seed Potato in Yunnan Province

ZHANG Lizhen, DONG Jiahong*, ZHENG Kuanyu, WU Kuo, SU Xiaoxia, FANG Qi, ZHANG Zhongkai*

( Biotechnology and Germplasm Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Provincial Key Lab of Agricultural Biotechnology, Key Lab of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation, Ministry of Agriculture, Kunming, Yunnan 650223，China )

Abstract:Theviral diseases are important constrains to yield and quality of potato. Invitroplantlets andminitubers are the key steps in the production of virus-free seed potato. In this research, 630 samples including 274 in vitro plantlets and 356 minitubers were collected from 2010 to 2013 in Yunnan Province.The samples were detected through the electron microscopy.DAS-ELISA was used to test PVS, PLRV, PVY, PVX, PVA, PVM, TSWV and TRSV. The results showed that PVS and PLRV were two predominant viruses, and 21.27%and 5.71%of the samples were infected by PVS and PLRV, respectively. TSWV and TRSV were two emerging viruses infecting potato in China. The results could provide a consult for detection and control of potato virus diseases in potato production.

Key Words:in vitro plantlet; minituber; virus-free seed potato; major virus; incidence; analysis

*通信作者（Corresponding author）：董家紅，研究員，主要從事植物病毒學研究，E-mail: dongjhn@126.com；張仲凱，研究員，主要從事植物病毒學研究，E-mail: zhongkai99@sina.com。

作者簡介：張麗珍（1968-），女，高級實驗師，主要從事馬鈴薯脫毒及病毒檢測。

基金項目：云南省現代農業馬鈴薯產業技術體系建設（2013KJTX003）；云南省農業科學院現代農業科研所及優秀團隊建設（2014CZYY021）；云南省高層次科技人才培引工程（2011CI134）。

收稿日期：2014-09-21

文章編號：1672－3635（2015）01-0042-04

文獻標識碼：B

中圖分類號：S532