天麻素通過激活AMPK通路減少油酸誘導的HL-7702細胞脂肪蓄積

網絡出版時間：2014-12-4 13:45網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.010.html

天麻素通過激活AMPK通路減少油酸誘導的HL-7702細胞脂肪蓄積

耿雅娜，于濱，孔維佳

(中國醫學科學院醫藥生物技術研究所，北京100050)

中國圖書分類號：R284.1；R322.47；R329.24；R344.3；R575.5；R589.2

摘要：目的研究天麻素(GSTD)對油酸(OA)誘導的HL-7702細胞脂肪蓄積的抑制作用，并探討其可能的細胞信號通路。方法以噻唑藍(MTT)法測定GSTD對HL-7702細胞存活率的影響；以1 mmol·L`(-1)的OA處理24 h誘導細胞脂肪變性，同時加入不同濃度的GSTD，油紅O(ORO)染色觀察細胞脂肪蓄積情況并測定細胞內三酰甘油(TG)含量；以Western blot檢測GSTD處理后細胞中AMPKα和ACC的磷酸化水平；以compound C處理細胞，研究其對GSTD藥效的影響。結果GSTD濃度≤3 386.5 μmol·L`(-1)時對HL-7702細胞沒有明顯毒性。OA處理24 h后細胞中出現大量脂滴蓄積，TG含量明顯增加，但同時加入濃度為169.3或338.7 μmol·L`(-1)的GSTD可明顯抑制HL-7702細胞的脂肪蓄積，并使TG含量分別平均下降35%和43.6%(與單加OA的細胞比較P<0.01)。GSTD處理后能時間和濃度依賴性地增加細胞中的p-AMPKα和p-ACC水平，compound C能完全阻斷GSTD對AMPK通路的激活作用以及減少肝細胞TG蓄積的作用。結論GSTD可明顯抑制OA誘導的HL-7702細胞脂肪蓄積，降低TG含量，其作用依賴于細胞中AMPK通路的激活。

關鍵詞：天麻素；油酸；HL-7702；脂肪變性；三酰甘油；AMPK

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.010

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0039-06

收稿日期:2014-09-21,修回日期:2014-11-08

基金項目：國家科技部“十二五”重大新藥創制科技重大專項(No 2012ZX09301-002-001)

作者簡介：耿雅娜(1990-)，女，碩士生，研究方向：代謝性疾病的分子藥理學，E-mail：gengyana227@126.com；

通訊作者孔維佳(1972-)，男，博士，研究員，博士生導師，研究方向：分子醫學與藥物，，E-mail：wjkong894@163.com

Abstract:AimTo study the inhibitory effect of gastrodin (GSTD) on oleic acid (OA)-induced fat accumulation in HL-7702 cells and explore possible cellular signaling pathways. MethodsThe MTT method was used to study the impact of GSTD on cell viability in HL-7702 cells. Cellular steatosis was induced by 1 mmol·L`(-1) of OA administration for 24 h, and different concentrations of GSTD were added at the same time. Oil red O (ORO) staining was used to determine fat accumulation in cells, and intracellular triglyceride (TG) contents were assayed. Western blot was used to determine the phosphorylation levels of AMPKα and ACC in cells after GSTD administration. Compound C was used to treat the cells in order to study its influence on the efficacies of GSTD. ResultsGSTD had no obvious toxicity in HL-7702 cells when its concentration was≤3 386.5 μmol·L`(-1). After 24 h of OA administration, there were large amounts of lipid droplets accumulated in HL-7702 cells, and intracellular TG contents greatly increased as well. However, when 169.3 or 338.7 μmol·L`(-1) of GSTD was added together with OA, fat accumulation in cells was greatly inhibited, and intracellular TG contents were reduced averagely by 35% and 43.6%, respectively (P<0.01 vs OA alone). After administration, GSTD could increase the levels of p-AMPKα and p-ACC in HL-7702 cells time and dose dependently. Compound C could completely abolish the stimulating activity of GSTD on AMPK pathway and block its reducing effect on hepatic TG accumulation. ConclusionsGSTD greatly inhibits OA-induced fat accumulation and reduces intracellular TG contents in HL-7702 cells; the efficacy of GSTD is dependent on the activation of cellular AMPK pathway.

隨著我國社會經濟的發展和城鄉人民生活水平的不斷提高，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)等代謝性疾病的患病率逐年增加。據統計，在2013年，NAFLD在我國的患病率已達15%[1]。NAFLD的主要病理特征是肝臟實質細胞脂肪蓄積和脂肪變性，如不加以干預，會影響肝功能并最終發展為肝硬化及肝癌[1]，嚴重危害人民健康。

天麻又名赤箭，屬蘭科植物，以其根莖入藥。天麻在我國已有上千年的應用歷史，目前臨床上主要用于治療眩暈、癲癇等神經系統疾病[2]。天麻具有多種藥理作用，如降血脂、降血糖、抗血小板聚集等[3-4]。另外，我們前期研究工作發現，天麻在NAFLD大鼠模型中能明顯減少動物的肝臟脂肪蓄積并改善肝功能[5]。天麻所含成分較復雜，如天麻素、天麻多糖、多種苷類和生物堿等[2]，目前其改善NAFLD的分子機制和細胞信號通路尚不明確。因此在本文中，我們利用油酸(oleic acid，OA)誘導建立了體外培養的肝細胞的脂肪變性模型，并研究了天麻的主要有效成分天麻素(gastrodin, GSTD)減少細胞脂肪蓄積的作用及其信號通路，GSTD化學結構式見Fig 1A。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞來源正常人肝細胞HL-7702細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

1.1.2主要試劑、藥物和儀器DMEM培養液和胎牛血清購自美國Gibco-Invitrogen公司；GSTD由浙江誠意藥業有限公司提供，以滅菌生理鹽水溶解；噻唑藍(MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所；Steatosis Colorimetric Assay Kit購自美國Cayman化學公司；三酰甘油(triglyceride，TG)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亞砜(DMSO)、OA和compound C購自美國Sigma-Aldrich公司；β-actin、AMP活化蛋白激酶α(AMPKα)、磷酸化AMPKα(p-AMPKα)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(p-ACC)單克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG以及Western blot stripping buffer均購自美國Santa Cruz公司；蛋白Marker、M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 和BCA Protein Assay kit均購自美國ThermoFisher公司；PVDF膜和ECL試劑盒購自美國Millipore公司；VICTOR X4 Multilabel酶標儀購自美國PerkinElmer公司；Olympus BX50光學顯微鏡和拍照系統購自日本奧林巴斯公司；電泳儀和電轉槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養HL-7702細胞常規培養于含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和抗生素的DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞生長至80%融合時，以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。取對數生長期細胞接種于6孔細胞培養板，培養24 h后棄去原培養液，換用含0.5%胎牛血清、1%非必需氨基酸和抗生素的DMEM培養液，血清饑餓24 h后進行試驗。

1.2.2細胞存活率測定細胞血清饑餓24 h后，以濃度為0~16 932.5 μmol·L-1的GSTD(每個濃度重復5次)處理24 h；以MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒按照說明書測定GSTD毒性，以酶標儀測定570 nm處吸光值(OD570)。細胞存活率/%(OD570給藥-OD570空白)/(OD570對照-OD570空白)×100%。

1.2.3OA誘導細胞脂肪變性OA溶于PBS緩沖液+5%BSA中[6]，分裝后置-20℃儲存。細胞血清饑餓24 h后，加入濃度為1 mmol·L-1的OA孵育24 h誘導脂肪變性[6]。

1.2.4藥物處理在脂肪染色和細胞TG測定實驗中，加OA的同時在培養液中加入0、67.7、169.3或338.7 μmol·L-1的GSTD(每個濃度重復3次)共同孵育24 h。AMPK和ACC磷酸化試驗中，細胞血清饑餓24 h后，以169.3 μmol·L-1的GSTD處理0~12 h，或以0~338.7 μmol·L-1的GSTD處理3 h。在使用compound C的實驗中，細胞血清饑餓24 h后，某些組別的細胞以濃度為10 μmol·L-1[7](溶于DMSO中)的compound C預處理30 min，其后除對照組外，所有細胞均加入1 mmol·L-1的OA(同時加入或不加入169.3 μmol·L-1的GSTD)。共同孵育12 h后,Western blot測定AMPK和ACC磷酸化水平；或孵育24 h后測定細胞內TG含量。

1.2.5細胞脂肪染色和定量利用Steatosis Colorimetric Assay Kit并參考說明書進行實驗。簡述如下：細胞棄去培養液，加入試劑盒中所提供固定液室溫孵育15 min，洗滌后加入油紅O(ORO)室溫孵育20 min；棄去ORO，洗滌并干燥后加入蘇木精，鏡下觀察結果并照相。脂肪蓄積定量則不加蘇木精，代以Dye Extraction Solution，孵育30 min后以酶標儀測定500 nm處吸光值，每個濃度重復3次，脂肪蓄積量以對照組細胞的倍數表示。

參考文獻1.2.6細胞內TG含量測定細胞做相應處理后以胰蛋白酶-EDTA消化，收集細胞后報道`([8]) ，以凍融法裂解細胞。取上清，以試劑盒測定TG濃度，并以BCA法測定蛋白濃度，細胞中TG含量以每g細胞蛋白中所含TG量(μmol·g`(-1))表示。

1.2.7Western blot細胞做相應處理后提取總蛋白，以BCA法測定蛋白濃度，每個樣品取50 μg蛋白，采用8%分離膠，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。用電轉法將蛋白質轉移到PVDF膜上后，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。根據蛋白Marker將膜剪成小條，依次與β-actin(1 ∶1 000)、p-AMPKα(1 ∶500)和p-ACC(1 ∶500)單克隆抗體室溫搖動孵育2 h，洗滌后與HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1 ∶2 500)室溫搖動孵育1 h，再洗滌后ECL試劑盒進行化學顯色并拍照。利用Western blot stripping buffer將用于檢測p-AMPKα和p-ACC的膜上結合的抗體洗脫后，重新與AMPKα(1 ∶500)和ACC(1 ∶500)單克隆抗體進行孵育以檢測其總表達水平。每個實驗重復3次，蛋白條帶以Gel-PRO ANALYZER gel analysis and electrophoresis analysis software (美國Media Cybernetics公司)定量分析，計算p-AMPKα/AMPKα以及p-ACC/ACC的比值，以百分數表示。

2結果

2.1GSTD對HL-7702細胞的毒性由Fig 1B可見，當GSTD濃度≤3 386.5 μmol·L-1時，對肝細胞沒有明顯毒性；當其濃度≥6 773 μmol·L-1時，細胞存活率的下降，差異有統計學意義。

2.2GSTD對OA誘導的HL-7702細胞脂肪蓄積的抑制作用如Fig 2A所示，對照細胞形態正常，只有很少量脂肪被紅染；而濃度為1 mmol·L-1的OA處理24 h后,ORO染色肝細胞中出現大量脂滴蓄積，表現為紅染面積明顯增加。脂肪定量結果與鏡下觀察結果一致，如Fig 2B所示，OA孵育后，HL-7702細胞中脂肪蓄積量較對照細胞增加6倍以上(P<0.01)，提示建模成功。濃度為169.3或338.7 μmol·L-1的GSTD與OA共同加入細胞中孵育24 h后，細胞中脂滴蓄積明顯減少，表現為鏡下ORO紅染面積明顯減少(Fig 2A)。脂肪定量結果與鏡下觀察相符合。如Fig 2B所示，與OA處理的細胞比較，169.3或338.7 μmol·L-1的GSTD使細胞中脂肪蓄積量分別平均下降40.3%(P<0.01)和48.6%(P<0.01)。

我們進一步測定了HL-7702細胞中的TG含量，結果如Fig 3所示。OA處理24 h后使細胞中TG量平均增加4.74倍(與對照細胞比較P<0.01)；GSTD在濃度為67.7 μmol·L-1時處理24 h即對肝細胞TG含量增加有明顯抑制作用，與OA處理的細胞比較，可使TG含量平均下降12.7%(P<0.05)。濃度為169.3或338.7 μmol·L-1的GSTD處理24 h后可使細胞中TG含量分別平均下降35%和43.6%(與OA處理的細胞比較均為P<0.01)。

細胞中的TG含量測定的結果與脂肪染色相符合，以上這些實驗結果提示GSTD對OA誘導的肝細胞脂肪蓄積有明顯的抑制作用。

a:Control;b:OA;c:OA+GSTD 169.3 μmol·L-1；d：OA+GSTD 338.7 μmol·L-1，**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsOA alone.

Fig 3　Effects of GSTD on intracellular TG contents in

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsOA alone

2.3GSTD對HL-7702細胞的AMPK通路的激活作用天麻和天麻素減少肝臟組織或細胞脂肪蓄積的具體機制尚不明確。由于細胞的AMPK信號通路在脂肪代謝中發揮關鍵作用[9]，我們檢測了GSTD是否能直接激活肝細胞AMPK。結果如Fig 4A所示，GSTD處理后能時間依賴性激活細胞AMPK，表現為p-AMPKα的水平和p-AMPKα/AMPKα比值增加。濃度為169.3 μmol·L-1的GSTD處理1 h后即出現p-AMPKα/AMPKα的比值有統計意義的增加(與對照細胞比較P<0.01)，并且至少維持12 h以上；GSTD對AMPKα總蛋白表達水平沒有影響。GSTD對AMPK的激活作用也是濃度依賴的，如Fig 4B所示，67.7 μmol·L-1的GSTD處理3 h即可明顯增加p-AMPKα水平和p-AMPKα/AMPKα比值(與對照細胞比較P<0.05)。作為AMPK的下游激酶，ACC的磷酸化水平在GSTD處理后也相應增加，并且呈時間(Fig 4A)和濃度(Fig 4B)依賴性，其趨勢與AMPK的磷酸化一致。以上這些實驗結果提示，GSTD作用于肝細胞后能直接激活AMPK信號通路。

2.4GSTD減少HL-7702細胞脂肪蓄積的作用依賴于AMPK通路為了證實AMPK通路在GSTD減少肝細胞脂肪蓄積的藥理作用中的關鍵角色，我們使用了一種AMPK特異性抑制劑compound C，并與OA和GSTD共同處理細胞。如Fig 5A所示，細胞培養液中加入OA后，p-AMPKα/AMPKα和p-ACC/ACC的比值較對照細胞明顯減少(P<0.05)，與文獻報道一致[10]；compound C預處理并與OA共同孵育后進一步減少細胞的p-AMPKα和p-ACC水平(與單加OA的細胞比較P<0.05)。GSTD與OA共同孵育后明顯增加p-AMPKα/AMPKα和p-ACC/ACC的比值(與單加OA的細胞比較P<0.01)，提示GSTD在OA存在的情況下也能激活細胞的AMPK通路。濃度為10 μmol·L-1的compound C預處理30 min并與OA和GSTD共同孵育后完全阻斷了GSTD對AMPK的激活作用，表現為p-AMPKα/AMPKα和p-ACC/ACC的比值較OA+GSTD處理細胞明顯減少(P<0.01)。

更為重要的是，我們發現GSTD減少肝細胞脂肪蓄積的作用依賴于AMPK通路的激活。如Fig 5B所示，單加compound C對OA誘導的肝細胞TG含量增加沒有任何作用；而用compound C預處理細胞并與OA+GSTD共同孵育后能完全阻斷GSTD減少肝細胞TG含量的藥效(與OA+GSTD組細胞比較P<0.01)。

3討論

本研究中，我們應用HL-7702細胞探討了天然產物GSTD減少肝細胞脂肪蓄積的藥理作用及可能的分子機制，并首先報道了GSTD對細胞 AMPK信號通路的激活作用。

我們的結果顯示，GSTD對肝細胞的毒性很低，在濃度≥6 773 μmol·L-1的條件下才影響細胞存活率，這與我們先前報道的天麻粉的毒性研究結果相吻合[11]。天麻粉在小鼠和大鼠中的最大耐受劑量(MTD)均超過15.0 g·kg-1體重，并且長期給藥對肝臟等器官未見明顯毒性[11]，下一步我們還將進行GSTD在動物中的毒理學研究。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsOA alone;ΔΔP<0.01vsOA+GSTD

本研究應用了OA來建立肝細胞脂肪變性模型，OA作為一種游離脂肪酸被認為能較好地在體外模擬NAFLD的病理變化[12]。我們的結果顯示GSTD對OA誘導的肝細胞脂肪蓄積和TG含量增加有明顯的抑制作用，這與我們先前的報道天麻明顯改善脂肪乳誘導的大鼠NAFLD相吻合[5]，因為GSTD是天麻的主要有效成分。

本研究最主要的發現是GSTD減輕肝細胞脂肪蓄積的作用依賴于細胞 AMPK信號通路的激活。AMPK是肝臟、脂肪組織和肌肉等代謝器官能量平衡和代謝調控的中樞性和關鍵分子，也是治療糖尿病、胰島素抵抗、血脂紊亂和NAFLD的重要靶點[9]。AMPK能磷酸化并抑制其下游激酶ACC，使丙二酰輔酶A合成減少[9]。丙二酰輔酶A是脂肪酸β氧化限速酶肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1(CPT1)的別構抑制劑，AMPK激活后能增加CPT1的活性，促進脂肪酸進入線粒體進行β氧化，從而促進脂肪的燃燒和代謝[9]。

AMPK通路還對脂肪的合成和分解代謝有全面影響，如通過下調固醇調節元件結合蛋白1c(SREBP1c)來抑制脂肪合成，并通過上調過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)來促進脂肪分解[13]。因此我們實驗室下一步的研究重點將放在GSTD對脂肪酸β氧化的影響，以及對SREBP1c和PPARα等分子的作用上，包括一系列體外實驗和動物實驗，從而深入全面地闡明GSTD抑制肝細胞脂肪蓄積的分子機制。

另外，GSTD是如何激活AMPK的尚不清楚。有一些天然藥物如小檗堿通過抑制線粒體中ATP的生物合成來激活AMPK從而改善代謝[14]，另有一些藥物如二甲雙胍能通過活化AMPK的上游激酶肝激酶B1(LKB1)來激活AMPK[15]。GSTD激活AMPK的具體機制是值得深入研究的。

綜上所述，本研究首次報道了GSTD通過激活AMPK信號通路來減少肝細胞脂肪蓄積的有益作用。由于目前臨床上NAFLD缺乏針對性藥物治療，本研究將為GSTD用于治療NAFLD提供科學依據。

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Gastrodin ameliorates oleic acid-induced fat accumulation through

activation of AMPK pathway in HL-7702 cells

GENG Ya-na, YU Bin, KONG Wei-jia

(InstituteofMedicinalBiotechnology,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100050,China)

Key words: gastrodin; oleic acid; HL-7702; steatosis; triglyceride; AMPK