黃芪和三七的主要有效成分配伍對腦缺血/再灌注小鼠NF-κB信號通路及炎性因子表達的影響

網(wǎng)絡出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.030.html

黃芪和三七的主要有效成分配伍對腦缺血/再灌注小鼠NF-κB信號通路及炎性因子表達的影響

黃小平，盧金冬，丁煌，鄧冰湘，唐映紅，鄧常清

(湖南中醫(yī)藥大學分子病理實驗室，中西醫(yī)結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙410208)

鄧常清(1963-), 男, 博士，教授, 博士生導師，研究方向：心腦血管疾病及中藥組(成)分配伍, 通訊作者,Tel: 0731-88458710, E-mail: dchangq@sohu.com

中國圖書分類號：R-332；R282.71；R289.1；R289.5；R322.81；R392.12；R743.31

摘要:目的從炎癥反應探討黃芪和三七主要有效成分配伍抗腦缺血/再灌注損傷的機制。方法將C57BL/6小鼠隨機分為假手術組、模型組、黃芪甲苷(AST Ⅳ)組、人參皂苷 Rg1(Rg1)組、人參皂苷Rb1(Rb1)組、三七皂苷R1(R1)組、4種有效成分配伍組、AST Ⅳ+Rg1組、AST Ⅳ+Rb1組、AST Ⅳ+R1組及陽性對照藥依達拉奉組。預先給藥3 d，末次給藥1 h后，結扎雙側頸總動脈，造成腦缺血20 min，再灌注24 h。RT-PCR法測定TNF-α、IL-1β、ICAM-1 mRNA表達，Western blot法測定腦組織p-IκBα蛋白及胞質(zhì)、胞核NF-κB蛋白表達，計算NF-κB核轉位率。結果①腦缺血/再灌注后，腦組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1 mRNA表達增加。AST Ⅳ可降低TNF-α mRNA表達，Rg1可降低ICAM-1 mRNA的表達，R1能同時下調(diào)TNF-α、ICAM-1 mRNA的表達。AST Ⅳ與Rg1、Rb1、R1配伍對TNF-α、IL-1β、ICAM-1 mRNA的表達均有不同程度的抑制作用，且以4種有效成分配伍組和AST Ⅳ+R1組對炎性細胞因子表達的抑制效應更加明顯。②腦缺血/再灌注后，腦組織p-IκBα蛋白表達明顯增加，胞質(zhì)NF-κB蛋白表達明顯減少，而胞核NF-κB蛋白表達增加，NF-κB核轉位率升高。AST Ⅳ、Rg1、R1及各有效成分配伍均能抑制IκB磷酸化，減少NF-κB核轉位的發(fā)生，且配伍組的效應大于各有效成分單用，4種有效成分配伍組的效應大于AST Ⅳ+Rb1 和AST Ⅳ+Rg1組。結論黃芪和三七的主要有效成分配伍能通過抑制缺血/再灌注后腦組織NF-κB信號通路的激活，減少炎性細胞因子的生成，從而減輕腦缺血后腦組織的繼發(fā)性炎癥反應，發(fā)揮對腦組織的保護作用。

關鍵詞：黃芪；黃芪甲苷；三七；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；三七皂苷R1；有效成分配伍；腦缺血/再灌注；NF-κB；信號通路；炎性細胞因子

收稿日期:2014-09-17,修回日期:2014-10-08

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81102557); 教育部2010年度高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(No 20104323110001); 湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金資助項目(No 11K050,14K068); 湖南省科技廳一般項目(No 2014SK3001)；湖南省中醫(yī)藥管理局重點項目(No 201301); 湖南省教育廳一般項目(No 11C0963)；“中西醫(yī)結合防治心腦血管疾病的相關基礎研究”湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊；“中醫(yī)藥防治心腦血管疾病基礎研究”湖南省自然科學創(chuàng)新群體基金

作者簡介:黃小平(1974-), 女, 碩士，副教授, 碩士生導師，研究方向：心腦血管疾病的防治, Tel: 0731-88458201, E-mail: jialeliu@hotmail.com；

通訊作者唐映紅(1962-), 女, 教授, 碩士生導師，研究方向：心腦血管疾病的中藥藥理學,,E-mail: tyhong62@sohu.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.030

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0141-06

Abstract:AimTo probe the possible mechanisms of the main active component combinations between Astragalus and Panax notoginseng antagonizing on ischemia-reperfusion injury from the perspective of the inflammatory response. MethodsC57BL/6 mice were randomly divided into the following group: sham, model, Astragaloside Ⅳ (AST Ⅳ), Ginsenoside Rg1 (Rg1), Ginsenoside Rb1 (Rb1), Notoginsenoside R1 (R1), four active component combination, AST Ⅳ+Rg1, AST Ⅳ+Rb1, AST Ⅳ+R1 and Edaravone, pretreated for 3 d. After 1 h of the last administration, the model of cerebral ischemic-reperfusion injury was established by bilateral common carotid artery (CCA) ligation for 20 min followed by reperfusion for 24 h. The expression of TNF-α, IL-1β, ICAM-1 mRNA was detected by RT-PCR, the expression of p-IκBα as well as NF-κB proteins of cytoplasm and nucleus in brain tissues was tested by Western blot,and NF-κB nuclear translocation rate was caculated. Results①After cerebral ischemia- reperfusion, the expressions of TNF-α, IL-1β, ICAM-1 mRNA in brain tissues were up-regulated. AST Ⅳ could down-regulate TNF-α mRNA expression, Rg1 could down-regulate ICAM-1 mRNA expression, R1 could decrease both TNF-α and ICAM-1 mRNA expressions, and AST Ⅳ combined with Rg1, Rb1, R1 had different degrees of inhibitions on TNF-a, IL-1β, ICAM-1 mRNA. Moreover, the inhibitory effects of four active component combination and AST Ⅳ+R1 on the inflammatory cytokines were more obvious. ②After cerebral ischemia-reperfusion, the expression of p-IκBα protein in brain tissues was significantly increased, NF-κB protein was significantly down-regulated in cytoplasm while up-regulated in nucleus, and nuclear translocation rate raised. AST Ⅳ, Rg1, R1 and the active component combinations could inhibit the phosphorylation of IκB, reduce the occurrence of NF-κB nuclear translocation, furthermore, the effects of the combination were better than those of the active components alone, and the effects of four active component combinations were better than those of AST Ⅳ+Rb1 and AST Ⅳ+Rg1. ConclusionThe main active component combinations between Astragalus and Panax notoginseng could reduce the productions of the inflammatory cytokines through restraining the activation of NF-κB signaling pathway, thus relieving secondary inflammatory reaction after cerebral ischemia and exerting protective effects on brain tissues.

腦缺血/再灌注后引起的炎癥反應在腦組織損傷過程中扮演重要角色。已有大量研究表明，腦缺血/再灌注后釋放大量炎癥信號，介導大量炎性細胞的聚集和炎性因子的釋放，進而引起腦組織水腫、破壞血腦屏障等，加重腦組織的損傷[1-3]。炎癥反應是腦缺血/再灌注后腦組織繼發(fā)性損傷的主要機制之一，其中包括轉錄因子的激活以及下游炎癥因子的釋放[4]。NF-κB是關鍵的轉錄因子家族，參與多種炎癥基因的轉錄調(diào)控，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用[5]。

黃芪和三七是治療心腦血管疾病的常用有效中藥，黃芪總苷(astragalosides，AST)是黃芪中具有心腦血管效應的主要藥效組分，主要含黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ, AST Ⅳ)；三七總皂苷(panax notoginseng saponins, PNS)是三七中具有心腦血管效應的主要藥效組分，主要含人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1, Rg1)、人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1, Rb1)和三七皂苷R1(notoginsenoside R1, R1)。我們以往的研究表明， AST和PNS配伍可增強抗腦缺血/再灌注損傷的效應，其作用與抗氧化應激損傷、保護血腦屏障等有關[6]。進而對其中4種主要有效成分配伍的研究表明，AST Ⅳ、Rg1、Rb1和R1配伍也可增強其抗腦缺血/再灌注損傷的作用，其作用與抗氧化應激損傷有關[7]，從而提示這4種有效成分為黃芪和三七抗腦缺血的主要藥效物質(zhì)，這些有效成分配伍可以增強其作用。為進一步闡明這4種有效成分配伍的作用機制，本研究從炎癥反應和NF-κB信號通路研究了黃芪甲苷和人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1配伍抗腦缺血/再灌注損傷的作用。

1材料

1.1實驗動物SPF級♂ C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18~22 g，由湖南維通利華實驗動物有限公司提供。動物合格證號為：SCXK(湘)2009-0004。飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，濕度45%、室溫25℃環(huán)境。

1.2受試藥物AST Ⅳ(批號：A0070)、Rg1(批號：A0237)、Rb1(批號：A0234)、R1(批號：A0273)，購自成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%，用時以5%羧甲基纖維素鈉配成混懸液備用。依達拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)，南京先聲東元制藥有限公司生產(chǎn)，批號80-090104，規(guī)格10 g·5 L-1，以生理鹽水配成0.4 g·L-1溶液。

1.3實驗試劑全蛋白提取試劑盒(批號：KGP2100)購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；細胞核和細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒(批號：SK3051)、磷酸酶抑制劑復合物Ⅲ(批號：PL019-1)、改良型BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒(批號：SK3051)購自上海生工生物工程股份有限公司；組織總RNA提取試劑盒(批號：Lo423)購自天根生物試劑有限公司；Reverse Transcription System逆轉錄試劑盒(批號：ADA3500)購自Promega；兔抗小鼠β-actin抗體(批號：sc-130656)，大鼠抗小鼠磷酸化IκBα(p-IκBα)抗體(批號：SC-8404)、兔抗小鼠NF-κB p65抗體(批號：SC-33020)購自Santa Gruz Biotechnology；辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉生物技術有限公司。

2方法

2.1腦缺血模型制作乙醚麻醉小鼠，仰臥位固定，在頸部正中做1 cm切口，暴露頸總動脈及伴行的迷走神經(jīng)，分離并夾閉雙側頸總動脈造成腦缺血，20 min后恢復血流[8]，再灌注24 h。假手術組也同樣進行手術，但不進行腦缺血和再灌注。再灌注24 h后，將小鼠迅速斷頭，取出腦組織置于冰上，去除小腦及腦干后檢測。

2.2動物分組和給藥方法根據(jù)前期實驗結果[9]，在小鼠腦缺血模型，4種有效成分配伍可對抗腦缺血后氧化應激，增強腦組織能量代謝，劑量以AST Ⅳ 40 +Rg1 50 +Rb1 40 +R1 10 mg·kg-1配伍作用最強。因此，本研究中4個有效成分配伍的劑量參考以往的研究結果。將小鼠隨機分為以下11組：假手術組、模型組、AST Ⅳ組(40 mg·kg-1)、Rg1組(50 mg·kg-1)、Rb1組(40 mg·kg-1)、R1組(10 mg·kg-1)、4種有效成分配伍組(AST Ⅳ 40 +Rg1 50 +Rb1 40 +R1 10 mg·kg-1)、AST Ⅳ(40 mg·kg-1)+Rg1(50 mg·kg-1)組、AST Ⅳ(40 mg·kg-1)+Rb1(40 mg·kg-1)組、AST Ⅳ(40 mg·kg-1)+R1(10 mg·kg-1)組、依達拉奉組(4 mg·kg-1)，每組8只小鼠。依達拉奉組腹腔注射給藥，每日給藥2次；其余各給藥組灌胃給藥，假手術組、模型組灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉，給藥體積均為10 mL·kg-1，每天給藥1次。連續(xù)3 d，d 3末次給藥1 h后造模。造模期間同前給藥。

2.3指標檢測

2.3.1RT-PCR法測定腦組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1 mRNA表達取右腦視交叉前組織50 mg，以TRIzol提取總RNA，測定A206/A280為1.8-2.0，純度>90%。逆轉錄成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，以此為模板進行PCR擴增。TNF-α基因引物：上游序列：5′-ATGGCCTCCCTCTCATCAGT-3′，下游序列：5′-TACCAGGGTTTGAGCTCAGC-3′，擴增片段為382 bp。IL-1β基因引物：上游序列：5′-CTCGCAGCAGCACATCAACA-3′，下游序列：5′-TGCCGTCTTTCATTACACAGGA-3′，擴增片段為428 bp。ICAM-1基因引物：上游序列：5′-GTGATGCTCAGGTATCCATCCA-3′，下游序列：5′-CACAGTTCTCAAAGCACAGCG-3′，擴增片斷213 bp。β-actin基因引物：上游序列：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，下游序列：5′-CCACAGGATTCCATACCCAA-3′，擴增片段446 bp。PCR反應體系 20 μL，擴增條件為：先95℃ 2 min，再94℃ 45 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，35循環(huán)。最后72℃ 延伸10 min。取擴增產(chǎn)物10 μL行1%瓊脂糖凝膠電泳，ChampGel 5500凝膠成像系統(tǒng)對目的條帶進行掃描，Image-pro plus圖像分析軟件測定目的條帶的積分光密度值(integrated optical density，IOD)，以目的條帶的IOD值與β-actin條帶的IOD值的比值即相對IOD半定量目的基因的表達強度。

2.3.2Western blot法測定腦組織p-IκBα及胞質(zhì)、胞核NF-κB蛋白表達取左腦視交叉前腦組織100 mg，加1 mL RIPA裂解液勻漿、冰上裂解30 min， 4℃下12 000 r·min-1離心5 min，取上清液。以改良型BCA蛋白質(zhì)定量法檢測蛋白質(zhì)含量，確定蛋白質(zhì)上樣總量110 μg，取蛋白樣品與1/3量的4×SDS凝膠上樣緩沖液混合使總體積為20 μL，煮沸變性5～10 min。SDS-PAGE 電泳分離2～3 h，300 mA恒流1 h濕轉至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS溶液封閉3 h，TBST溶液洗3次。再分別與兔抗小鼠β-actin抗體(1 ∶1 000)、大鼠抗小鼠p-IκBα抗體(1 ∶1 000)、兔抗小鼠NF-κBp65抗體(1 ∶200)溶液3 mL混合，4℃靜置過夜，TBST溶液洗3次。然后與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1 ∶1 000)5~8 mL室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。取增強型DAB底物顯色試劑盒進行顯影，將PVDF膜進行掃描，Image Pro-Plug6.0圖像分析軟件測定目的條帶的IOD，以β-actin為內(nèi)參照，以目的條帶的IOD值與β-actin條帶的IOD值的比值作為該目的蛋白的相對表達量。由于NF-κB必須發(fā)生核轉位，進入細胞核后才可以啟動下游炎性細胞因子的表達，故本文以NF-κB核轉位率來評價其活化情況，NF-κB核轉位率=胞核相對表達量/(胞核相對表達量+胞質(zhì)相對表達量)。

3結果

3.1各組腦組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1 mRNA表達的比較見Fig 1，Tab 1。與假手術組比較，模型組TNF-α表達明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，AST Ⅳ、R1、4種有效成分配伍及AST Ⅳ+Rb1、AST Ⅳ+R1組TNF-α表達明顯降低(P<0.01或P<0.05)。且AST Ⅳ+Rb1組 TNF-α的表達低于Rb1組(P<0.05)，AST Ⅳ+R1組TNF-α的表達低于AST Ⅳ及R1單用組(均P<0.01)且AST Ⅳ+Rg1組IL-1β的表達低于AST Ⅳ及Rg1單用組(均P<0.01)。4種有效成分配伍降低TNF-α表達的效應強于各有效成分單用及AST Ⅳ+Rg1、AST Ⅳ+Rb1組(均P<0.01)。

與假手術組比較，模型組IL-1β 表達明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，4種有效成分配伍、AST Ⅳ+Rg1、AST Ⅳ+R1及依達拉奉組IL-1β 表達明顯下降(P<0.01或P<0.05)。且AST Ⅳ+Rg1組IL-1β的表達低于AST Ⅳ及Rg1單用組(均P<0.01),4種有效成分配伍降低IL-1β mRNA表達的效應強于各有效成分單用及AST Ⅳ+Rb1、AST Ⅳ+R1(均P<0.01)。

與假手術組比較，模型組ICAM-1表達明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，Rg1、R1、4種有效成分配伍、AST Ⅳ+Rg1、AST Ⅳ+R1組ICAM-1表達明顯下降(P<0.01或P<0.05)。且AST Ⅳ+Rg1、AST Ⅳ+R1降低ICAM-1表達的效應分別強于Rg1、R1 及AST Ⅳ單用(P<0.01或P<0.05)；4種有效成分配伍降低ICAM-1表達的效應強于各有效成分單用及AST Ⅳ+Rg1、AST Ⅳ+Rb1組(均P<0.01)。

3.2各組腦組織p-IκBα，胞質(zhì)、胞核NF-κB蛋白表達和NF-κB核轉位率的比較見Fig 2，Tab 2。與假手術組比較，模型組p-IκBα蛋白表達明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，AST Ⅳ、Rg1、R1及各配伍組均能明顯降低p-IκBα蛋白的表達(P<0.01或P<0.05)。且配伍組降低p-IκBα蛋白表達的效應強于各有效成分單用組(均P<0.01)，4種有效成分配伍組的效應強于AST Ⅳ+Rb1組(P<0.05)，與AST Ⅳ+Rg1、AST Ⅳ+R1及依達拉奉組比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

Fig 1TNF-α, IL-1β, ICAM-1 mRNA maps in

brain tissues among the groups

1: Sham; 2: Model; 3: Astragaloside Ⅳ; 4: Ginsenoside Rg1; 5: Ginsenoside Rb1; 6: Notoginsenoside R1; 7: Four active component combination; 8: AST Ⅳ+Rg1; 9: AST Ⅳ+Rb1; 10: AST Ⅳ+R1; 11: Edaravone. The same below

GroupTNF-αIL-1βICAM-1Sham0.70±0.110.34±0.120.41±0.16Model3.59±0.18◇◇1.07±0.17◇◇2.38±0.28◇◇ASTⅣ3.36±0.20△▲▲0.95±0.20▲▲2.28±0.21▲▲Rg13.54±0.19▲▲0.92±0.19▲▲2.07±0.25△▲▲Rb13.44±0.22▲▲0.94±0.17▲▲2.12±0.30▲▲R13.37±0.19△▲▲0.95±0.22▲▲2.07±0.26△▲▲Fouractivecomponentcombination2.80±0.12△△**□□■■☆☆0.61±0.09△△**□□■■☆☆1.40±0.15△△**□□■■☆☆ASTⅣ+Rg13.49±0.23▲▲0.64±0.10△△**□□1.79±0.22△△**□▲▲ASTⅣ+Rb13.24±0.21△△■▲▲0.96±0.17▲▲2.25±0.31▲▲ASTⅣ+R12.92±0.11△△**☆☆0.88±0.17△▲▲1.55±0.29△△**☆☆Edaravone2.84±0.18△△0.61±0.10△△1.46±0.26△△

◇◇P<0.01vssham;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel;**P<0.01vsAST Ⅳ;□P<0.05,□□P<0.01vsRg1;■P<0.05,■■P<0.01vsRb1;☆☆P<0.01vsR1;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsfour active component combination。The same below。

與假手術組比較，模型組胞質(zhì)NF-κB蛋白表達明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，除Rb1外，各給藥組胞質(zhì)NF-κB蛋白表達明顯增加(P<0.01或P<0.05)。且AST Ⅳ+Rg1、AST Ⅳ+R1組NF-κB蛋白表達的增加大于Rg1、R1 及AST Ⅳ單用組(均P<0.01)；AST Ⅳ+Rb1組NF-κB蛋白表達的增加大于Rb1單用(P<0.05)；4種有效成分配伍組NF-κB蛋白表達的增加大于4種有效成分單用及AST Ⅳ+Rb1組(均P<0.01)，與AST Ⅳ+Rg1、AST Ⅳ+R1及依達拉奉組比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

與假手術組比較，模型組胞核NF-κB蛋白表達明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，除Rb1外，各給藥組胞核NF-κB蛋白表達明顯減少(P<0.01或P<0.05)。且AST Ⅳ+Rb1組胞核NF-κB蛋白表達的減少高于Rb1組(P<0.01)，AST Ⅳ+R1組胞核NF-κB蛋白表達的減少分別高于AST Ⅳ、R1單用組(均P<0.01)。4種有效成分配伍組胞核NF-κB蛋白表達的減少高于4種有效成分單用組及AST Ⅳ+Rg1、AST Ⅳ+Rb1組，與AST Ⅳ+R1及依達拉奉比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

與假手術組比較，模型組NF-κB核轉位率明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，除Rb1外，各給藥組均能明顯抑制NF-κB核轉位率的增加(均P<0.01)。且配伍組降低NF-κB核轉位率的效應大于各有效成分單用(P<0.01或P<0.05)，4種有效成分配伍組的效應大于AST Ⅳ+Rg1、AST Ⅳ+Rb1組，與AST Ⅳ+R1及依達拉奉比較差異無顯著性(均P>0.05)。

Fig 2Western blot patterns of p-IκBa protein as well as NF-κB protein in cytoplasm and nucleus in brain tissues among groups

4討論

當腦缺血/再灌注發(fā)生時，腦內(nèi)膠質(zhì)細胞、腦血管內(nèi)皮細胞、血小板等釋放大量的TNF-α、IL-1、血小板激活因子等促炎性細胞因子[10]，促炎性細胞因子激活白細胞、內(nèi)皮細胞后，通過釋放蛋白酶和氧自由基，使白細胞和血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子，從而誘導白細胞及血小板等粘附于微血管內(nèi)，導致血流中斷或堵塞。活化后的白細胞在血管內(nèi)聚集，通過釋放蛋白水解酶等，損傷血管內(nèi)皮，導致血腦屏障破壞和腦水腫發(fā)生；活化白細胞還可釋放大量的炎性介質(zhì)，使更多的中性粒細胞發(fā)生聚集、浸潤，加重炎性反應[11]。TNF-α在炎癥網(wǎng)絡中具有關鍵作用，是全身炎性反應的始動介質(zhì)，可誘導IL-1、IL-6和黏附分子表達釋放，使炎性損傷的級聯(lián)效應放大[12-14]。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，是重要的黏附分子之一，介導白細胞向血管內(nèi)皮細胞的黏附，誘導血管內(nèi)膜的炎癥反應。腦缺血后， 腦組織IL-1表達增加，其中主要是IL-1β。IL-1能誘導腦微血管內(nèi)皮細胞黏附分子及趨化因子的表達，促進白細胞浸潤，引起炎癥反應[15]。動物實驗表明，IL-1β在大鼠大腦中動脈缺血2 h后，再灌注0~24 h內(nèi)IL-1β等炎癥細胞因子逐漸增加，且24 h后達到高峰[16]。

Tab 2Comparision of p-IκBα, NF-κB proteins of cytoplasm, nucleus and

Groupp-IκBα cytoplasmNF-κB nucleusNF-κB NF-κBnucleartranslocationrate Sham0.04±0.010.66±0.070.04±0.020.06±0.03Model0.23±0.03◇◇0.41±0.04◇◇0.20±0.02◇◇0.33±0.03◇◇ASTⅣ0.20±0.02△▲▲0.48±0.06△▲▲0.17±0.02△▲▲0.27±0.03△△▲▲Rg10.20±0.02△▲▲0.47±0.05△▲▲0.17±0.01△▲▲0.27±0.02△△▲▲Rb10.21±0.02▲▲0.46±0.05▲▲0.20±0.02▲▲0.31±0.02▲▲R10.20±0.02△▲▲0.47±0.04△▲▲0.17±0.03△▲▲0.27±0.02△△▲▲Fouractivecomponentcombination0.12±0.02△△**□□■■☆☆0.60±0.06△△**□□■■☆☆0.12±0.02△△**□□■■☆☆0.17±0.03△△**□□■■☆☆ASTⅣ+Rg10.13±0.02△△**□□0.56±0.04△△**□□0.16±0.04△△▲▲0.22±0.03△△**□□▲▲ASTⅣ+Rb10.14±0.03△△**■■▲0.52±0.05△△■▲▲0.16±0.02△△■■▲▲0.24±0.04△△*■■▲▲ASTⅣ+R10.13±0.02△△**☆☆0.58±0.05△△**☆☆0.13±0.02△△**☆☆0.18±0.01△△**☆☆Edaravone0.14±0.03△△0.57±0.04△△0.12±0.02△△0.18±0.02△△

◇◇P<0.01vssham;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel;**P<0.01vsAST Ⅳ;□P<0.05,□□P<0.01vsRg1;■P<0.05,■■P<0.01vsRb1;☆☆P<0.01vsR1;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsfour active component combination

本研究結果顯示，腦缺血/再灌注后，腦組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1 mRNA表達均升高，提示缺血缺氧刺激可引起炎性細胞因子的表達。AST Ⅳ和Rg1單用可以分別降低TNF-α和ICAM-1的表達，R1能同時減少TNF-α和ICAM-1的表達。黃芪和三七有效成分單用對IL-1β表達沒有影響。AST Ⅳ+Rg1 能降低IL-1β、ICAM-1的表達，AST Ⅳ+Rb1僅能降低TNF-α的表達，AST Ⅳ+R1及4種有效成分配伍對TNF-α、IL-1β、ICAM-1表達的升高均具有明顯抑制作用。提示4種有效成分配伍可以增強對腦缺血/再灌注后腦組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1等炎癥因子表達的抑制作用，其對IL-1β表達的抑制作用可能主要來自于AST Ⅳ+Rg1，對TNF-α和ICAM-1表達的抑制作用可能主要來自于AST Ⅳ+R1。

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞內(nèi)的轉錄因子。靜息狀態(tài)下NF-κB與κB抑制蛋白-α(IκB-α)結合，以失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)中。當細胞受到某些細胞因子、氧化應激及內(nèi)毒素等刺激時，使IκB磷酸化及降解，IκB與NF-κB解離，后者迅速移位至細胞核，并與核內(nèi)DNA特定靶部位結合，啟動相關靶基因轉錄，參與調(diào)節(jié)細胞因子、黏附分子表達、免疫反應及炎癥反應等。而一些炎性細胞因子(IL-1、IL-2、TNF-α)、黏附分子(VCAM-1、ICAM-1)及轉錄生長因子(TGF-β)等又可誘導NF-κB進一步活化，形成正反饋作用，刺激NF-κB活化，加重炎癥反應[17-18]。

本研究結果顯示，腦缺血/再灌注后，腦組織p-IκBα蛋白表達增加，NF-κB核轉位率增加。提示腦缺血后導致IκB磷酸化及降解，IκB與NF-κB解離，使NF-κB發(fā)生了核轉位。AST Ⅳ、Rg1、R1及各有效成分配伍均能抑制IκB磷酸化，減少NF-κB核轉位的發(fā)生，且配伍組的效應大于各有效成分單用，4種有效成分配伍組的效應大于AST Ⅳ+Rg1及AST Ⅳ+Rb1組。表明AST Ⅳ與三七的主要有效成分配伍抑制炎性細胞因子表達的作用可能與抑制NF-κB信號通路的激活有關。

綜上所述，黃芪和三七的4種有效成分配伍可以增強對腦缺血/再灌注后腦組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1等炎癥因子表達的抑制作用，其機制可能與抑制缺血/再灌注后腦組織NF-κB信號通路的激活，從而減少炎性因子的生成有關。

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Effects of main active component combinations between Astragalus

and Panax notoginseng on NF-κB signaling pathway and expressions

of inflammatory factors after cerebral ischemia-reperfusion in mice

HUANG Xiao-ping, LU Jin-dong, DING Huang, DENG Bing-xiang, TANG Ying-hong, DENG Chang-qing

(MolecularPathologyLaboratory,KeyLaboratoryofHunanProvinceforPreventionandTreatmentofIntegratedTraditional

ChineseandWesternMedicineonCardio-CerebralDiseases,KeyLaboratoryofHunanUniversitiesforCellBiology

andMolecularTechniques,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

Key words: Astragalus; Astragaloside Ⅳ; Panax notoginseng; Ginsenoside Rg1; Ginsenoside Rb1; Notoginsenoside R1; active component combinations; cerebral ischemia-reperfusion; NF-κB signaling pathway; inflammatory cytokines