甲基硝基亞硝基胍對哈薩克族正常食管上皮細胞LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化及其表達的影響

甲基硝基亞硝基胍對哈薩克族正常食管上皮細胞LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化及其表達的影響

陳艷1， 鄧彥超2,3， 黃思語1

(1新疆醫科大學公共衛生學院，2新疆醫科大學第一附屬醫院胸外科，3新疆食管癌研究所， 烏魯木齊830011)

摘要:目的探討N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)對哈薩克族(哈族)正常食管上皮細胞LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化及其表達的影響。方法將體外培養的哈族正常食管上皮細胞暴露于含0、0.75、1.5、3 μg/mL MNNG的培養基中24 h，分別為對照組、0.75 μg/mL組、1.50 μg/mL組、3.00 μg/mL組。用甲基化特異性聚合酶鏈(MSP)法檢測LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化狀態，用RT-PCR和Western Blot法檢測LRRFIP1、ALDH1L1基因mRNA和蛋白表達。結果與對照組比較，各濃度組細胞LRRFIP1基因甲基化狀態沒有改變；各組細胞LRRFIP1基因mRNA表達水平分別為(1.021±0.237)、(2.828±0.350)、(1.453±0.179)、(1.952±0.223);與對照組比較,0.75 μg/mL組和3.00 μg/mL組表達均升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，1.50 μg/mL和3.00 μg/mL組LRRFIP1蛋白表達水平均升高，分別為(4.233±0.048)、(4.519±0.033)、(5.377±0.057)，差異有統計學意義(P<0.05)；高濃度組細胞ALDH1L1基因有從部分甲基化向完全甲基化轉變的趨勢，各組ALDH1L1基因mRNA表達水平分別為(1.023±0.254)、(5.046±0.603)、(2.259±0.030)、(7.616±1.910)，與對照組比較各濃度組均升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)；各組細胞ALDH1L1蛋白表達水平分別為(0.725±0.014)、(0.913±0.033)、(1.142±0.010)、(1.334±0.047)，與對照組比較各濃度組均升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)。結論MNNG可促進哈族正常食管上皮細胞ALDH1L1基因甲基化及LRRFIP1、ALDH1L1表達的升高。

關鍵詞：哈薩克族； 食管上皮細胞； LRRFIP1； ALDH1L1

中圖分類號：R735.1文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.008

[收稿日期：2014-09-22]

Effects of MNNG on methylation and expression of LRRFIP1, ALDH1L1

on Kazakh normal esophageal epithelial cells

CHEN Yan1, DENG Yanchao2,3, HUANG Siyu1

(1PublicHealthCollege,XinjiangMedicalUniversity,2DepartmentofChestSurgery,

TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,3XinjiangInstituteforEsophageal

CancerResearch,Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of MNNG on methylation and expressions of LRRFIP1 and ALDH1L1 on Kazakh normal esophageal epithelial cells. MethodsMethylation of LRRFIP1 and ALDH1L1 were detected by MSP, the mRNA and protein level of LRRFIP1 and ALDH1L1 were detected by RT-PCR and Western Blot. ResultsCompared with the control group, each group of cells with LRRFIP1 gene methylation status did not change, the expressions of LRRFIP1 mRNA level in each groups were (1.021±0.237), (2.828 ±0.350), (1.453±0.179), (1.952±0.223), the LRRFIP1 mRNA level in low concentration group and high concentration group of cells were significantly higher than the control group (P<0.05), the expressions of LRRFIP1 protein level in control group and high concentration group were (4.233±0.048), (5.377±0.057), the LRRFIP1 protein level in high concentration group of cells were significantly higher than the control group (P<0.05), high concentration group of cells with ALDH1L1 gene was trended from partial methylation to completely methylation, the expressions of ALDH1L1 mRNA level in each groups were (1.023±0.254), (5.046±0.603), (2.259 ±0.030), (7.616±1.910), the ALDH1L1 mRNA level in each group was significantly higher than the control group (P<0.05), the expressions of ALDH1L1 protein level in each groups were (0.725±0.014), (0.913±0.033), (1.142±0.010), (1.334±0.047), the ALDH1L1 protein level in each concentration groups were significantly increased (P<0.05). ConclusionAt some concentration point, MNNG significantly affects the methylation of ALDH1L1 and the expressions of p16 and FHIT on Kazakh normal esophageal epithelial cells.

Key words: Kazakh; esophageal epithelial cells;LRRFIP1;ALDH1L1

亞硝胺類化合物屬亞硝基化合物，包括亞硝胺與亞硝酞胺兩類。目前為止已發現的亞硝胺有300多種，其中90%以上的亞硝胺化合物對動物有致畸、致突變及致癌作用[1]。N-亞硝胺類烷化劑能誘導多種疾病的發生。研究結果表明，N-亞硝胺類化合物是誘發人類癌癥的原因之一[2-3]。N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是一種人工合成的亞硝胺類化合物，常被用于研究亞硝胺類化合物誘發腫瘤的工具。動物實驗證明，MNNG可以導致多種腫瘤的發生[4-5]。富含亮氨酸重復序列相互作用蛋白1[(leucinerich repeat(in FLII) interacting protein 1，LRRFIP1)]基因位于人類17號染色體上，是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的信號組成成分[6]。醛脫氫酶1家族L1基因(aldehyde dehydrogenase 1 family member L1，ALDH1L1)位于人類3號染色體的長臂上(3q21.2)，參與細胞增殖的調節，是存在于細胞質中的一個與葉酸代謝有關的酶基因[7]。本課題組的前期研究結果表明，在哈薩克族(哈族)食管癌患者癌組織中LRRFIP1和ALDH1L1基因發生了甲基化[8-9]。本研究使用MNNG對體外培養的哈族食管正常上皮細胞染毒，從而模擬N-亞硝胺類化合物暴露后，正常食管上皮細胞LRRFIP1和ALDH1L1基因甲基化狀態及其表達的變化，初步探討N-亞硝胺類化合物致食管上皮組織發生病變的機制。

1材料與方法

1.1細胞與主要試劑哈族食管正常上皮細胞株(課題組自行培養的原代細胞)，MNNG(TCI公司)，甲基化修飾試劑盒(Chemicon公司)，Trizon提取試劑盒(Invitrogen公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(Ambion公司)，引物(上海生工生物工程技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養哈族食管正常上皮細胞常規培養于EpicM-2無血清培養基中(內含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)，37℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞生長匯合至90%時按照1∶3傳代培養。待細胞生長至對數期時培養瓶加入含不同濃度(0、0.75、1.50、3.00 μg/mL)MNNG的培養基5 mL，分別為對照組、0.75 μg/mL組、1.50 μg/mL組和3.00 μg/mL組。

1.2.2MSP法檢測LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化狀態

1.2.2.1總DNA的提取細胞染毒24 h后，采用血液基因組DNA快速抽提試劑盒提取總DNA。

1.2.2.2甲基化特異性PCR(1)引物合成：由上海生工生物工程公司設計、合成，引物序列見表1。(2)亞硫酸氫鈉修飾：采用甲基化修飾試劑盒對提取的DNA進行修飾。(3)擴增體系：包括dNTPs 0.5 μL、Forward primer 0.5 μL、Reverse primer 0.5 μL、DNA模板2.0 μL、Taq Buffer 2.5 μL、MgCl22.0 μL、Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，加水補至25 μL。PCR反應條件：95℃預變性4 min，94℃變性25 s(甲基化63℃、非甲基化60℃)，72℃延伸30 s，共25個循環，最后72℃ 5 min。將擴增好的DNA行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統BioSens Gel Imaging System軟件照相處理。

1.2.3RT-PCR法檢測LRRFIP1、ALDH1L1 mRNA表達

1.2.3.1總RNA提取及cDNA合成采用Trizol提取試劑盒提取細胞內總RNA，第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。

表1　啟動子區特異性引物序列

1.2.3.2聚合酶鏈式反應PCR(1)引物合成：由上海生工生物工程公司設計、合成，以管家基因GAPDH為內參，引物序列見表2。(2)擴增體系：包括SybrGreen qPCR Master Mix(2×) 10.0 μL 、上游與下游引物各1.0 μL 、cDNA 1.0 μL 、ddH2O 7.0 μL，總體積20 μL。PCR反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性10 s，LRRFIP1、ALDH1L1基因58℃和GAPDH基因57℃ 40 s，60℃延伸40 s，共40個循環，最后72℃ 5 min。將擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用2-△△CT法分析目的基因在對照組和各濃度組的表達差異。

表2　逆轉錄PCR引物序列

1.2.4Western blot 法檢測LRRFIP1、ALDH1L1蛋白表達細胞經不同濃度MNNG染毒24 h后，加入細胞裂解液，充分混勻，離心，將提取的蛋白變性，10% SDS-PAGE電泳，濕轉法低壓轉膜2.5 h。TBST漂洗后用5%的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，TBST漂洗后將PVDF膜放入稀釋的一抗(LRRFIP1抗體1∶200、ALDH1L1抗體1∶200、GAPDH抗體1∶1 000)中4℃過夜孵育。TBST漂洗，PVDF膜放入稀釋的辣根酶標記的二抗溶液中，37℃孵育l h。在暗室中避光顯色，并照X線片。用凝膠圖像掃描分析系統對所得目的蛋白與內參蛋白的X線片分析，用灰度分析軟件對每個條帶的灰度值進行測定，獲得每條目的蛋白及內參蛋白的灰度值，目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

2結果

2.1LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化狀態

2.1.1LRRFIP1基因甲基化檢測結果 哈族食管上皮細胞經MNNG作用24 h后，對照組與0.75、1.50、3.00 μg/mL組的PCR反應產物電泳結果見圖1。各組均可見LRRFIP1基因無甲基化的特異性基因片段(186 bp)表達，未見LRRFIP1基因甲基化特異性基因片段(185 bp)表達，說明哈族食管正常上皮細胞經不同濃度MNNG染毒24 h后LRRFIP1基因甲基化狀態保持無甲基化狀態不變。

M：LRRFIP1-M特異性引物擴增條帶185 bp；U：LRRFIP1-U特異性引物擴增條帶186 bp，1、2、3、4分別為對照組和0.75、1.50 、3.00 μg/mL組，5為甲基化基因標準品

圖1MSP法檢測哈族食管上皮細胞經MNNG染毒后LRRFIP1基因甲基化狀態

2.1.2ALDH1L1基因甲基化檢測結果 哈族食管上皮細胞經MNNG作用24 h后，對照組和0.75、1.50、3.00 μg/mL組的PCR反應產物電泳結果見圖2。各組均可見ALDH1L1基因無甲基化特異性基因片段(127 bp)及ALDH1L1基因甲基化特異性基因片段(115 bp)的表達。3.00 μg/mL組無甲基化特異性片段亮度明顯較對照組和0.75、1.50 μg/mL組弱，而甲基化特異性片段亮度較對照組和0.75、1.50 μg/mL組強，說明3.00 μg/mL組ALDH1L1基因啟動子區有部分胞嘧啶發生了甲基化。

2.2LRRFIP1、ALDH1L1基因mRNA及蛋白表達

2.2.1LRRFIP1基因mRNA表達 MNNG染毒24 h后，各組細胞間LRRFIP1基因表達水平不同，差異有統計學意義(F=27.680，P<0.05)。0.75 μg/mL組LRRFIP1基因表達水平上調，是對照組的2.828倍，差異有統計學意義(t=7.398，P<0.01)；與對照組比較，1.50 μg/mL組LRRFIP1基因表達水平差異無統計學意義(t=2.515，P>0.05)；與對照組比較，3.00 μg/mL組LRRFIP1基因表達水平是對照組的1.952倍，差異有統計學意義(t=4.940，P<0.01)，見表3。

M： ALDH1L1-M特異性引物擴增條帶115 bp；U：ALDH1L1-U特異性引物擴增條帶127 bp，1、2、3、4分別為對照組和0.75、1.50 、3.00 μg/mL組，5為甲基化基因標準品

圖2MSP法檢測哈族食管上皮細胞經MNNG染毒后

ALDH1L1基因甲基化狀態

2.2.2LRRFIP1蛋白表達哈族正常食管上皮細胞經MNNG染毒24 h后，各組細胞LRRFIP1蛋白表達水平不同，差異有統計學意義(F=139.271，P<0.01)，LRRFIP1蛋白表達水平隨染毒劑量的增加而升高(r=0.888，P<0.01)。與對照組比較，0.75 μg/mL組LRRFIP1蛋白表達差異無統計學意義(t=3.488，P>0.05)；1.50 μg/mL和3.00 μg/mL組LRRFIP1蛋白表達水平均明顯高于對照組，差異均具有統計學意義(t=6.894，P<0.05； t=20.599， P<0.01)，見表3、圖3。

1：對照組； 2：0.75 μg/mL； 3：1.50 μg/mL； 4：3.00 μg/mL

圖3　哈族食管上皮細胞經MNNG染毒后LRRFIP1蛋白表達

注: 與對照組比較，△P<0.05； 與0.75 μg/mL組比較，▲P<0.05； 與1.50 μg/mL組比較，#P<0.05。

2.2.3ALDH1L1基因mRNA表達 MNNG染毒24 h后，各組細胞間ALDH1L1基因表達水平不同，差異均有統計學意義(F=25.561，P<0.05)，ALDH1L1基因表達水平隨染毒劑量的增加而升高(r=0.764，P<0.05)。與對照組比較，0.75 μg/mL組ALDH1L1基因表達水平是對照組的5.046倍，ALDH1L1基因表達水平上調，差異有統計學意義(t=10.648，P<0.01)；與對照組比較，1.50 μg/mL組ALDH1L1基因表達水平是對照組的2.259倍，ALDH1L1基因表達水平上調，差異有統計學意義(t=8.377，P<0.01)；3.00 μg/mL組ALDH1L1基因表達水平上調是對照組的7.616倍，差異有統計學意義(t=5.926，P<0.01)，見表4。

2.2.4ALDH1L1蛋白表達 哈族正常食管上皮細胞經MNNG染毒24 h后，各組細胞ALDH1L1蛋白表達水平不同，差異有統計學意義(F=156.617，P<0.01)，ALDH1L1蛋白表達水平隨染毒劑量的增加而升高(r=0.976，P<0.01)。與對照組相比，0.75、1.50 、3.00 μg/mL組ALDH1L1蛋白表達水平均高于對照組，差異均具有統計學意義(t′=7.410，P<0.05；t=33.861，P<0.01；t′=17.493，P<0.01)，見表4、圖4。

1：對照組； 2：0.75 μg/mL； 3：1.50 μg/mL； 4：3.00 μg/mL

圖4哈族食管上皮細胞經MNNG染毒后ALDH1L1蛋白表達

3討論

食管癌(esophageal cancer, EC)是發生于食管上皮組織的常見消化系統惡性腫瘤，主要流行于發展中國家，世界食管癌發病率存在顯著的地域差異，高發區與低發區人群食管癌死亡率和發病率相差可達500倍[10]。不同種族食管癌發病率有很大差異，新疆是我國食管癌高發區之一，以哈薩克族人群死亡率最高[11]。

研究表明LRRFIP1基因在動物胚胎發育、表皮生長、平滑肌細胞的發育以及腫瘤和心血管病的發病中發揮重要作用[12]。新疆哈薩克族食管鱗癌DNA異常甲基化基因發現LRRFIP1基因在癌組織中發生甲基化[13]。在乳腺癌患者非癌組織中LRRFIP1蛋白表達弱陽性，而乳腺浸潤性導管癌和浸潤性小葉癌組織中超過50%的組織表達強陽性，并且LRRFIP1基因的表達強度與淋巴浸潤程度有關[14]。

表4　哈族食管上皮細胞經MNNG染毒后ALDH1L1基因及蛋白表達(n=3, ±s)

注： 與對照組比較，△P<0.05； 與0.75 μg/mL組比較，▲P<0.05； 與1.50 μg/mL組比較，#P<0.05。

研究表明ALDH1L1基因有類似抑癌基因的特性，具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用[15-16]。Natalia等[7]檢測肺腺癌細胞系A549、肝癌細胞系HePG2和結腸癌細胞系HCT116的啟動子CpG島甲基化水平，結果表明這3種細胞系的ALDH1L1基因啟動子均發生甲基化。本課題組的前期研究結果表明新疆哈薩克族食管鱗癌DNA異常基因甲基化中ALDH1L1基因發生甲基化，該基因參與甲酰四氫葉酸的分解代謝及一碳化合物的分解代謝[13]。ALDH1L1基因在多種腫瘤細胞系中低表達，包括肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌細胞系等[17]。Natalia等[16]對肺腺癌組織及相對應癌旁組織和肝癌組織及相對應癌旁組織ALDH1L1基因mRNA和蛋白表達進行檢測，研究結果表明，在肺腺癌組織及肝癌組織中ALDH1L1基因mRNA和蛋白表達水平均低于對應的癌旁組織。研究發現ALDH1L1基因在肝癌中的表達，在癌組織中ALDH1L1 mRNA及蛋白表達水平與正常組織相比顯著下降，癌旁正常組織ALDH1L1 mRNA表達水平是癌組織的10倍，ALDH1L1基因表達下降影響是肝癌患者預后的危險因素[18]。

本研究采用不同濃度MNNG對哈族正常食管上皮細胞染毒24 h后檢測各濃度組LRRFIP1、ALDH1L1基因的甲基化狀態及其表達。研究結果表明，LRRFIP1基因一直處于無甲基化狀態，而經高濃度MNNG處理后的哈族食管上皮細胞ALDH1L1基因甲基化特異性片段表達較對照組和0.75、1.5 μg/mL組高，非甲基化特異性片段表達較對照組和低、中濃度組低，說明高濃度MNNG使得哈族食管上皮細胞ALDH1L1基因有甲基化的趨勢。與對照組比較，LRRFIP1和ALDH1L1基因mRNA及蛋白表達水平均與MNNG濃度呈正相關，隨MNNG濃度的增高表達上調。說明基因甲基化的發生是基因表達下調的原因之一，在哈族食管癌的發生過程中，最先發生甲基化的是與葉酸代謝有關的基因ALDH1L1，這對今后預防哈族食管癌的發生具有重要意義。

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(本文編輯楊晨晨)