腺病毒36感染對(duì)人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞PPARγ和adiponectin基因表達(dá)的影響

腺病毒36感染對(duì)人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞PPARγ和adiponectin基因表達(dá)的影響

努爾比耶·努爾麥麥提1， 焦誼1， 伊力亞斯·艾薩1， 地力木拉提·艾克熱木2，

開(kāi)色爾·喀米力2， 陸建飛1， 常曦1， 關(guān)亞群1

(1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室， 烏魯木齊830011；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院， 烏魯木齊830001)

摘要：目的探討腺病毒36感染對(duì)人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)和脂聯(lián)素(adiponectin)基因表達(dá)的影響。方法無(wú)菌條件下獲取人皮下脂肪組織、I型膠原酶消化并收集人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞( human adipose-derived mesenchymal stem cell，hAMSC),細(xì)胞傳至第3代(P3代)對(duì)hAMSC進(jìn)行定向成脂誘導(dǎo)，并進(jìn)行油紅O染色；流式細(xì)胞儀檢測(cè)hAMSC表面免疫表型；人類腺病毒36 (adenouirus-36,Ad36 )感染hAMSC，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real time-PCR)方法檢測(cè)Ad36感染的hAMSC PPARγ和adiponectin基因表達(dá)的變化規(guī)律。結(jié)果(1)hAMSC在體外呈梭形生長(zhǎng)，且能穩(wěn)定傳代；(2)細(xì)胞在加入成脂誘導(dǎo)劑后可定向分化成脂肪細(xì)胞；(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示hAMSC免疫表型：CD105 (93.0±1.3)%，CD44 (99.6±0.3)%，CD34(0.2±0.1)%，CD45(0.2±0.3)%，CD31(0.3±0.3)%， CD29(3.4±0.2)%；(4) Ad36感染hAMSC后細(xì)胞內(nèi)脂滴逐漸增多、增大。 PPARγ和adiponectin基因在Ad36感染hAMSC后的第1天開(kāi)始表達(dá)，感染后第2~6天較0 MOI組顯著升高(P<0.05),至感染后第8天10 MOI劑量組表達(dá)水平開(kāi)始下降。結(jié)論Ad36使hAMSC定向分化成脂肪細(xì)胞，并上調(diào)了PPARγ和adiponectin基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞； 腺病毒36； PPARγ； adiponectin

中圖分類號(hào)：R: 34文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.009

[收稿日期：2014-11-17]

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81060021)

作者簡(jiǎn)介：包馨慧(1989-)，女，在讀碩士，研究方向：心血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

The variation of PPARγ and adiponectin genes expression in adenouirus-36

infected human adipose-derived mesenchymal stem cell

Nuerbiye Nuermaimaiti1， JIAO Yi1， Yiliyasi Aisa1， Dilimulati Aikeremu2， Kaiseer Kamili2，

LU Jianfei1， CHANG Xi1， GUAN Yaqun1

(1DepartmentofBiochemistry，PreclinicalMedicineCollege，XinjiangMedicalUniversity，

Urumqi830011,China；2XinjiangUygurAutonomousRegionalPeople’sHospital，Urumqi830001,China)

Abstract:ObjectiveThe objective of this study was to investigate the variation of PPARγ and adiponectin gene expression in adenouirus-36 infected human adipose-derived mesenchymal. MethodsWe isolated adipose-tissue from a patient under sterile condition, collected human adipose-derived mesenchymal stem cell (hAMSC) with collagenase I， cultivated cells till passage 3 to differentiate into adipogenic cells. The immune phenotype were examined under flow cytometry. The expression of PPARγ and adiponectin genes were determined in Ad36 infected hAMSC. Results(1) hAMSC grew spindle-shaped in vitro and passaged stably; (2) hAMSC differentiated into adipogenic cells after cultivated with adipogenic inducer；(3) The results of flow cytometry: CD105 (93±1.25)%, CD44 (99.6±0.3)%, CD34(0.2±0.06)%, CD45(0.2±0.25)%, CD31 (0.3±0.25)%, CD29(3.4±0.2)%. (4) Ad36 induced lipid accumulation in hAMSC, and the expression of PPARγ and adiponectin increased gradually in hAMSC and reached highest level at 6 day′s post infection. ConclusionAd36 induced lipid accumulation and upregulated PPARγ and adiponectin genes.

Key words: human adipose-derived mesenchymal stem cell； adenouirus-36； PPARγ； adiponectin

肥胖癥是指體內(nèi)脂肪堆積過(guò)多或分布異常、體質(zhì)量增加的一種多因素慢性代謝性疾病。無(wú)論是在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，目前肥胖都是廣泛流行的多因性代謝疾病[1]。肥胖能引起機(jī)體代謝紊亂，導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，影響人的健康及壽命，已成為一個(gè)世界范圍內(nèi)的社會(huì)和健康問(wèn)題[2]。美國(guó)科學(xué)家Dhurandhar等[3]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖的發(fā)生與人類腺病毒36型(adenouirus-36，Ad36)感染有關(guān)。Ad36感染小鼠后，增加脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)聚集和胰島素敏感性，其功能與噻唑烷二酮類(Thiazolidinediones，TZDs)藥物相似[4]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)主要表達(dá)于脂肪組織，與脂肪細(xì)胞分化及胰島素抵抗關(guān)系密切。脂聯(lián)素(adiponectin)是脂肪細(xì)胞特異分泌的細(xì)胞因子，具有增加胰島素敏感性和調(diào)節(jié)糖、脂代謝的作用。本研究選取人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè) Ad36感染對(duì)hAMSC PPARγ和adiponectin基因表達(dá)水平的影響，旨在探討PPARγ和adiponectin基因與Ad36引起的肥胖間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象收集人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSC)，細(xì)胞取自就診于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科擇期手術(shù)患者，男性，31歲，維吾爾族，BMI 22.6 kg/m2。無(wú)急性炎癥、腫瘤及其他內(nèi)分泌疾病和各種傳染性疾病。本研究已通過(guò)倫理委員會(huì)審核。

1.2hAMSC的培養(yǎng)和傳代手術(shù)中無(wú)菌條件下取1塊脂肪組織，于含1 000 U/mL 青/鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡15 min后，用PBS反復(fù)沖洗3次至液體澄清為止，用眼科剪將脂肪組織剪成糊狀，根據(jù)脂肪組織的體積按1∶1比例置于1 mg/mL的Ⅰ型膠原酶中，37℃水浴中震蕩消化約30 min，直至懸液成糊狀，加20 mL PBS稀釋消化液，2 600 r/min離心10 min 后棄油脂和上清，加入含10%胎牛血清(Hyclone公司)的低糖-DMEM培養(yǎng)液重懸，制成單細(xì)胞懸液，接種于10 cm平皿中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后換液，以后2 d換液1次。細(xì)胞匯合達(dá)到80%時(shí)消化傳代。

1.3hAMSC的成脂誘導(dǎo)取第4代細(xì)胞匯合達(dá)到80%后加入成脂誘導(dǎo)劑(含F(xiàn)BS、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛)，3 d換1次液，分別于誘導(dǎo)后第3、5、7、9天進(jìn)行油紅O染色。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)hAMSC免疫表型取第4代細(xì)胞，用Trypsin-EDTA(Gibco 公司)消化后，PBS洗2遍，制成單細(xì)胞懸液，設(shè)陰性對(duì)照和同型對(duì)照組，分別加單克隆抗體CD29-PE、CD44-FITC、CD105-PE、CD31-FITC、CD34-PE、CD45-FITC，于4℃避光孵育30 min,PBS洗3遍，洗掉多余的抗體后進(jìn)行流式細(xì)胞儀(Beckman 公司)檢測(cè)。

1.5腺病毒36感染取第5代細(xì)胞匯合達(dá)到80%后饑餓處理(不含F(xiàn)BS的低糖-DMEM)過(guò)夜(12 h)，細(xì)胞分別用0、2.5、5、10、30病毒接種量(MOI)， 置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,換含10%FBS、1%雙抗的低糖-DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。病毒感染后第4天進(jìn)行油紅O染色。檢測(cè)Ad36標(biāo)記基因E1A，鑒定Ad36是否感染成功。

1.6hAMSC總RNA的提取不同劑量的病毒感染hAMSC細(xì)胞后的第1、2、4、6、8天用經(jīng)典Trizol法提取hAMSC細(xì)胞的總RNA，應(yīng)用 Gene Quant 核酸定量分析儀測(cè)定總RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。

1.7PPARγ、adiponectin、E1A 基因 mRNA表達(dá)的檢測(cè)引物設(shè)計(jì)與合成： 應(yīng)用primer 5.0 設(shè)計(jì)人PPARγ、adiponectin、E1A與內(nèi)參照β-actin的引物，由上海生工生物工程有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1　RT-PCR引物序列

2結(jié)果

2.1hAMSC的形態(tài)學(xué)特征原代細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈短梭形，貼壁生長(zhǎng)(圖1)。原代細(xì)胞傳3代后，細(xì)胞呈形態(tài)大小一致的細(xì)小梭形，貼壁生長(zhǎng)(圖2)。

圖1　原代P0代細(xì)胞(×100)

2.2hAMSC的定向成脂誘導(dǎo)成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，鏡下可見(jiàn)透明脂滴出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，脂滴逐漸增多并有匯集現(xiàn)象。分別對(duì)第3、5、7、9天的細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，出現(xiàn)紅色提示為脂肪細(xì)胞(圖3)。

2.3hAMSC的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hAMSC細(xì)胞免疫表型結(jié)果: CD31 (0.3±0.3)%，CD105 (93.0±1.3)%，CD44 (99.6±0.3)%，CD34(0.2±0.06)%，CD45(0.2±0.3)%，CD29(3.4±0.2)%(圖4)。

圖2　原代P3代細(xì)胞(×50)

A: 誘導(dǎo)分化第3天(×200)B: 誘導(dǎo)分化第5天(×200)C: 誘導(dǎo)分化第7天(×200)D: 誘導(dǎo)分化第9天(×200)

圖3油紅O染色

A: CD105-PEB: CD31-FITCC: CD44-FITC

D: CD45-FITCE: CD34-PEf: CD29-PE

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hAMSC細(xì)胞免疫表型結(jié)果

2.4Ad36感染對(duì)hAMSC細(xì)胞的影響

2.4.1Ad36標(biāo)記基因E1A的表達(dá)Ad36的標(biāo)記基因E1A在對(duì)照組未表達(dá)，在Ad36感染組表達(dá)，說(shuō)明Ad36成功感染hAMSC(圖5)。

2.4.2Ad36感染對(duì)hAMSC細(xì)胞形態(tài)的影響分別用5、10、30 MOI Ad36病毒感染hAMSC細(xì)胞2 d后，鏡下可見(jiàn)透明脂滴出現(xiàn)，隨著劑量和時(shí)間增加，脂滴逐漸增多，至第6天30 MOI感染的細(xì)胞出現(xiàn)脫脂和細(xì)胞脫落的現(xiàn)象。感染后的第4天，分別對(duì)3種不同劑量病毒感染的hAMSC細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性(圖6)。

A: E1A擴(kuò)增曲線　　　　B: E1A溶解曲線

A: 5 MOI Ad36感染后第4天B: 10 MOI Ad36感染后第4天C: 30 MOI Ad36感染后第4天

圖6油紅O染色

圖7　Ad36感染對(duì)hAMSC細(xì)胞PPARγ mRNA表達(dá)水平的影響

表2　Ad36感染對(duì)hAMSC細(xì)胞PPARγ mRNA表達(dá)水平的影響( ±s)

注：與0 MOI組比較，*P<0.05。

2.4.4Ad36感染對(duì)hAMSC細(xì)胞adiponectin基因表達(dá)的影響與0 MOI組比較，Ad36感染后第1天， adiponectin基因在30 MOI劑量組中表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。第2天，10、30 MOI劑量組表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。第4天，10 MOI劑量組表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。第6天，2.5、5、10 MOI劑量組表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。第8天，2.5、5、10 MOI劑量組表達(dá)水平升高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3，圖8)。

圖8　Ad36感染對(duì)hAMSC細(xì)胞adiponectin mRNA表達(dá)水平的影響

3討論

肥胖是世界范圍內(nèi)廣泛流行的健康問(wèn)題之一，是導(dǎo)致心腦血管疾病的高危因素，其增加了糖尿病、高血壓、高脂血癥等多種疾病的發(fā)病率，是危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一[1]。因此，肥胖發(fā)生機(jī)制的研究得到了越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。導(dǎo)致肥胖的原因很多，包括遺傳因素、攝食行為、環(huán)境和心理因素等。肥胖的發(fā)生與人類腺病毒36型感染有關(guān)[3]。Ad36與人類肥胖以及Ad36與鼠、雞、獼猴、小猿和兔子等動(dòng)物肥胖的關(guān)系已被證實(shí)[3]。Atkinson等[5]對(duì)威斯康星、佛羅里達(dá)及紐約的502名受試者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其中肥胖人群的Ad36感染率為30%，而非肥胖人群的Ad36感染率只有11%，并且感染Ad36和未感染Ad36的人群相比其體質(zhì)量升高，血脂卻降低。另外，本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，維吾爾族肥胖患者Ad36感染率明顯高于非肥胖組，感染Ad36的肥胖患者表現(xiàn)出血糖、血脂降低等特點(diǎn)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Ad36感染能夠促進(jìn)大鼠脂肪的形成并改善胰島素敏感性，其作用類似于噻唑烷二酮[7]，并且Ad36 的E4orf1基因被認(rèn)為是導(dǎo)致嚙齒類動(dòng)物和人脂肪細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑[8]。另外，人骨骼肌細(xì)胞和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，E4orf1通過(guò)使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)上調(diào)來(lái)增加細(xì)胞的糖攝取[8]。盡管如此，目前Ad36導(dǎo)致肥胖的細(xì)胞和分子機(jī)制尚不清楚。而Ad36與人類肥胖關(guān)系研究中缺少適當(dāng)?shù)哪Ｐ驼侨缃袼媾R的問(wèn)題之一。

表3　Ad36感染對(duì)hAMSC細(xì)胞adiponectin mRNA表達(dá)水平的影響

注：與0 MOI組比較，*P<0.05。

Pasarica等[9]使用3T3-L1前脂肪細(xì)胞作為細(xì)胞模型。然而3T3-L1前脂肪細(xì)胞已經(jīng)定向成脂肪細(xì)胞，在增殖、分化、功能方面都有一定的局限性。而且3T3-L1前脂肪細(xì)胞是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞展開(kāi)人類基因方面的研究會(huì)有一定的局限性。基于3T3-L1模型用于人類研究的局限性和人類在體試驗(yàn)的困難，有必要構(gòu)建Ad36感染的人類脂肪細(xì)胞模型。本研究選用的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSC)，是具有多向分化能力的細(xì)胞，可以定向分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞，其增殖、分化能力也比較強(qiáng)。由于hAMSC具有獲取容易、獲得量大、對(duì)機(jī)體損傷少等優(yōu)點(diǎn)，使其成為當(dāng)前干細(xì)胞領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本研究對(duì)hAMSC的生物學(xué)特性及增殖特點(diǎn)進(jìn)行闡述，從hAMSC的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、定向成脂分化能力、流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型3個(gè)方面證明本研究成功獲得hAMSC。本研究使用成脂誘導(dǎo)劑將hAMSC定向分化成了成熟的脂肪細(xì)胞。Ad36感染hAMSC后能表達(dá)Ad36標(biāo)志基因E1A，Ad36能成功感染hAMSC。而且Ad36感染hAMSC后在未添加成脂誘導(dǎo)劑的條件下能使hAMSC誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞，改變hAMSC中的基因表達(dá)，為后續(xù)Ad36感染人類脂肪細(xì)胞的研究提供了合適的細(xì)胞模型。

PPARγ屬核受體超家族成員，是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的重要因子；PPARγ又是胰島素增敏劑-噻唑烷二酮類藥物(TZDs)作用的靶分子，TZDs與其結(jié)合后，調(diào)控與胰島素效應(yīng)有關(guān)的多種基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮TZDs降血糖、降血脂以及增加外周組織的胰島素敏感性等作用，因此PPARγ與脂肪細(xì)胞分化、肥胖、高脂蛋白血癥、2型糖尿病等關(guān)系密切[10]。Adiponectin是脂肪細(xì)胞特異分泌的細(xì)胞因子，具有增強(qiáng)胰島素敏感性和調(diào)節(jié)糖類、脂質(zhì)代謝的作用，可改善高胰島素血癥和胰島素抵抗。有研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖、2型糖尿病及心血管疾病患者中，通常伴有胰島素抵抗和高胰島素血癥，其血漿adiponectin水平均有下降[11]。肥胖患者血漿adiponectin降低與胰島素抵抗及高胰島素血癥有關(guān)。Adiponectin是連接肥胖與胰島素抵抗、高胰島素血癥、2型糖尿病的一種介質(zhì)[12]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，維吾爾族肥胖患者血漿adiponectin水平下降，而感染Ad36 的肥胖患者與非感染36的肥胖患者比較，血漿adiponectin水平顯著升高并伴有血脂、血糖水平降低等特點(diǎn)。維吾爾族肥胖患者與非肥胖患者中PPARγ表達(dá)水平?jīng)]有差異，而感染Ad36的肥胖患者與非感染36的肥胖患者比較，PPARγ表達(dá)水平顯著升高。提示，Ad36感染可能調(diào)節(jié)了維吾爾族肥胖患者PPARγ和adiponectin表達(dá)水平的變化，2個(gè)細(xì)胞因子可能均與Ad36引起的肥胖相關(guān)，但機(jī)制尚待闡明。

本研究結(jié)果顯示， Ad36感染hAMSC后的第2天細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)透明脂滴，到第6天，90%視野內(nèi)的細(xì)胞都出現(xiàn)脂滴，而未感染Ad36的對(duì)照組始終沒(méi)有出現(xiàn)脂滴。說(shuō)明，Ad36可以增加hAMSC脂質(zhì)聚集，使hAMSC定向分化成脂肪細(xì)胞。另外，感染Ad36的hAMSC較未感染Ad36的hAMSC其PPARγ表達(dá)水平顯著升高。PPARγ是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的重要因子，這與Ad36增加hAMSC脂質(zhì)聚集，使hAMSC定向分化成脂肪細(xì)胞的結(jié)果一致。提示，Ad36可能通過(guò)上調(diào)PPARγ表達(dá)水平，進(jìn)一步調(diào)控其下游基因的轉(zhuǎn)錄，最終實(shí)現(xiàn)hAMSC的定向分化。Adiponectin能增強(qiáng)胰島素敏感性，調(diào)節(jié)糖類、脂質(zhì)代謝，但肥胖和2型糖尿病患者其表達(dá)水平降低[12-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染Ad36的hAMSC與未感染Ad36的hAMSC比較，adiponectin表達(dá)水平顯著升高，與本課題組在人類研究中血漿adiponectin的表達(dá)變化一致，提示Ad36可能通過(guò)上調(diào)adiponectin表達(dá)而最終發(fā)揮增加胰島素敏感性、改善高血糖癥等作用。但這其中的作用機(jī)制目前尚不清楚。

綜上所述，Ad36使hAMSC定向分化成脂肪細(xì)胞，并上調(diào)了PPARγ和adiponectin基因的表達(dá)。

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三是水工程建設(shè)和管理仍相對(duì)滯后。盡管我國(guó)已初步形成了蓄引提調(diào)相結(jié)合的水資源配置格局和基于大江大河干流的防洪減災(zāi)體系，但洪災(zāi)水患問(wèn)題和工程性缺水仍普遍存在，水利投入仍存在較大缺口。農(nóng)田水利、中小河流治理、農(nóng)村飲水安全工程、小型水庫(kù)病險(xiǎn)率高等問(wèn)題突出，亟待加強(qiáng)專項(xiàng)治理。

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(本文編輯周芳)

通信作者：李曉梅, 女，博士，副主任醫(yī)師，副教授，研究方向：冠脈介入的基礎(chǔ)及臨床研究，E-mail: Lixm505@163.com。