肉蓯蓉苯乙醇苷類成分對BSA致大鼠肝纖維化影響的實驗研究

肉蓯蓉苯乙醇苷類成分對BSA致大鼠肝纖維化影響的實驗研究

木克熱木·吐地買提1， 由淑萍1， 趙軍2， 馬龍1， 張石蕾1， 劉濤1

(1新疆醫科大學公共衛生學院毒理學教研室， 烏魯木齊830011；2新疆維吾爾自治區藥物研究所， 烏魯木齊830004)

摘要:目的觀察肉蓯蓉苯乙醇苷類成分(CPhGs)對牛血清白蛋白(BSA)致大鼠肝纖維化的防治作用。方法將SD大鼠隨機分為6組，每組12只，即正常對照組、肝纖維化模型組(模型組)、復方鱉甲軟肝片陽性對照組(600 mg/kg)及CPhGs高劑量組(500 mg/kg)、中劑量組(250 mg/kg)、低劑量組(125 mg/kg)；采用靜脈注射BSA誘導建立大鼠肝纖維化模型；造模同時,灌胃給予大鼠CPhGs提取物，連續12 w，末次給藥后腹主動脈采血，取出肝臟和脾臟。計算肝脾指數，檢測大鼠血清肝功能指標及肝臟病理組織學變化。結果與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟指數明顯增加，血清AST含量明顯增加。與模型組比較，復方鱉甲軟肝片陽性對照組及CPhGs不同劑量組大鼠肝臟指數均顯著降低，CPhGs不同劑量組大鼠脾臟指數明顯下降，CPhGs不同劑量組大鼠血清ALT、AST含量顯著下降。CPhGs可使BSA誘導的大鼠肝臟纖維增生明顯減輕。病理結果顯示，正常對照組大鼠肝組織未見異常，CPhGs不同劑量組治療效果顯著，形態基本上接近于正常對照組。結論肉蓯蓉苯乙醇苷類成分具有保護肝細胞和防治肝纖維化的作用。

關鍵詞:肉蓯蓉; 苯乙醇苷類成分； 肝纖維化； 牛血清白蛋白

中圖分類號：R966文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.011

[收稿日期：2014-09-06]

An experimental study of Cistanche phenylethanoid glycosides on

liver fibrosis induced by BSA in rats

Mukaram Tudimat1， YOU Shuping1， ZHAO Jun2， MA Long1， ZHANG Shilei1， LIU Tao1

(1DepartmentofToxicology，CollegeofPublicHealth，XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China;2XinjiangUygurAutonomousRegionInstituteofMateriaMedica,

Urumqi830004,China)

Abstract:ObjectiveTo observe prevention and treatment effect of Cistanche phenylethanoid glycosides to bovine serum albumin (BSA) induced liver fibrosis in rats. MethodsUsing intravenous injection of BSA immunity induced rat liver fibrosis model. Meanwhile, orally administered to rats CPhGs extract for 12 weeks, after the last administration of abdominal aortic blood, remove the liver and spleen. Calculation of liver indices and spleen indices, detection of ALT,AST in rat serum and liver pathological histology changes. ResultsCompared with the normal group, model group organize index significantly increased, serum AST was significantly increased. Compared with the model group, liver index of Biejiaruangan tablets group and CPhGs different dose groups were significantly decreased, spleen index of CPhGs different doses significantly decreased, serum ALT and AST of CPhGs different dose groups were significantly decline. CPhGs can reduce rat liver fibrosis induced by BSA. ConclusionCPhGs can protect liver cells, prevent and treat of liver fibrosis in rats.

Key words: Cistanche; phenylethanoid glycosides; liver fibrosis; bovine serum albumin

肉蓯蓉(Cistanche)屬多年生根寄生草本植物，是名貴中藥材，具有補腎、益精、潤腸、抗衰老等功效，由于其生長于沙漠環境，又有“沙漠人參”之美譽。國內外學者對肉蓯蓉的化學成分進行了大量研究，迄今為止已經分離出約70種化合物，包括苯乙醇苷類、環烯醚萜類、木脂素類化合物以及生物堿和糖類等其他成分，其中最主要成分為苯乙醇苷類化合物[1]。苯乙醇苷類成分具有很強的抗菌、抗炎、抗病毒、抑制彈性蛋白酶、抗氧化、免疫調節、增強記憶及強心等多種藥理活性[2]。本實驗從肉蓯蓉藥材中分離得到苯乙醇苷類化合物，并研究其對牛血清白蛋白(BSA)所致大鼠肝纖維化的防治作用，旨在為肉蓯蓉中苯乙醇苷類化合物的抗肝纖維化作用機制及相關保健品或藥品的開發提供依據。

1材料和方法

1.1藥材與儀器肉蓯蓉苯乙醇苷類成分提取物(CPhGs)由新疆藥物研究所植物化學室提供。用時將藥物配制成不同濃度，置4℃冰箱保存待用。復方鱉甲軟肝片(內蒙古福瑞科技股份有限公司產品，批號：20131006)，牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公司產品，CAS:9048-46-8，原裝進口)。羊毛脂(上海源葉生物科技公司)，液體石蠟(天津市富宇精細化工有限公司)，磷酸鹽緩沖液(飛世爾生物化學制品(北京)有限公司，批號：NZD1132)。

電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)，立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)，L-530多管架自動平衡離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，全自動生化分析儀(邁瑞公司，系列號:A086A0182)。

1.2實驗動物SD大鼠72只，雄性，體質量(200±20)g，SPF級，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號:SYXK(新)2003-0001。

1.3實驗方法

1.3.1弗氏不完全佐劑的制備稱量羊毛脂50 g置于燒杯中，加入100 mL液體石蠟，加熱至70℃混勻，高壓滅菌后備用。

1.3.2大鼠免疫性肝纖維化模型的建立造模分為致敏階段和尾靜脈攻擊階段：(1)致敏階段：除正常對照組大鼠注射生理鹽水(每次每只0.5 mL)以外，其余各組動物均多點皮下注射含9 mg/mL BSA的弗氏不完全混合乳化液，每次每只0.5 mL，共5 次。前2次注射間隔為14 d，后3次注射間隔為7 d。末次致敏注射后1 w，于眼內眥靜脈叢采血，采用雙向擴散法檢測大鼠血清抗BSA抗體；(2)尾靜脈攻擊階段：抗體陽性大鼠繼續進行尾靜脈攻擊，即模型組及給藥組大鼠尾靜脈注射BSA，每只首次2 mL，每周2次，其后濃度逐漸升至每次4 mL/只，連續5 w，共10次。

1.3.3實驗分組及藥物干預SD大鼠隨機分為6組，每組12只，即正常對照組、肝纖維化模型組(模型組)、復方鱉甲軟肝片陽性對照組(600 mg/kg)及CPhGs高劑量組(500 mg/kg)、中劑量組(250 mg/kg)、低劑量組(125 mg/kg)。CPhGs不同劑量組和陽性對照組在造模的同時按劑量灌胃給藥，每天1次，持續12 w。

1.4指標檢測各組末次給藥后禁食(不禁水)12 h，稱重，經戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，腹主動脈采血， 3 500 r/min離心10min，取血清測定谷草轉氨酶(ALT)、谷丙轉氨酶(AST)；采血后處死大鼠，剖取肝臟和脾臟，稱量肝臟及脾臟濕重，計算肝臟指數和脾臟指數(臟器指數=臟器重量/體質量×100)。取肝臟左葉同一部位，固定，切片，常規HE染色，進行病理組織學觀察。肝纖維化分級參照文獻[3]分為5級：0級：無纖維化；Ⅰ級：纖維結締組織僅限于匯管區或匯管區有擴大，有向小葉發展的傾向；Ⅱ級：纖維結締組織增生明顯，超過小葉的2/3并伴有Ⅰ級改變；Ⅲ級：纖維結締組織進入肝小葉中央靜脈周圍；Ⅳ級：纖維結締組織在全小葉呈多處彌漫性增生，有假小葉形成，并有Ⅲ級改變。

2結果

2.1CPhGs對BSA致肝纖維化大鼠臟器系數的影響與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟指數明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，復方鱉甲軟肝片組及CPhGs不同劑量組大鼠肝臟指數明顯下降，CPhGs不同劑量組大鼠脾臟指數明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2CPhGs對BSA致肝纖維化大鼠肝功能酶指標的影響與正常對照組比較, 模型組 ALT含量增加，但差異沒有統計學意義；AST含量增加，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較, CPhGs高劑量組大鼠血清ALT含量顯著降低；復方鱉甲軟肝片組及CPhGs高、中、低劑量組大鼠血清AST含量顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)，結果見表2。

表1　CPhGs對BSA致肝纖維化大鼠臟器系數的影響( ±s)

注： 與正常對照組比較,*P<0.05； 與模型組比較,#P<0.05。

2.3CPhGs對BSA致肝纖維化大鼠病理組織學的影響正常對照組大鼠肝組織未見異常, 肝小葉結構正常,肝細胞無變性壞死(圖1)。模型組大鼠肝纖維化呈Ⅲ～Ⅳ級纖維化，纖維結締組織進入肝小葉中央靜脈周圍，纖維結締組織在全小葉呈多處彌漫性增生，有假小葉形成(圖2)。復方鱉甲軟干片陽性對照組與模型組比較病理變化有所緩解，纖維結締組織在小葉彌漫性增生減少(圖3)。CPhGs高、中劑量組病理組織切片顯示肝組織形態基本上接近于正常對照組，肝細胞無變性壞死，無肝纖維化(圖4、5)。CPhGs低劑量組纖維結締組織僅限于匯管區或匯管區有擴大，有向假小葉發展的傾向(圖6)。

表2　CPhGs對BSA致肝纖維化大鼠肝功酶指標的影響( ±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

圖1正常對照組大鼠肝組織病理切片(HE染色，20×10)

圖2模型組大鼠肝組織病理切片(HE染色，20×10)

圖3鱉甲軟肝片組大鼠肝組織病理切片(HE染色，20×10)

圖4GPhGs高劑量組大鼠肝組織病理切片(HE染色, 20×10)

圖5GPhGs中劑量組大鼠肝組織病理切片(HE染色，20×10)

圖6GPhGs低劑量組大鼠肝組織病理切片(HE染色，20×10)

3討論

肝纖維化是指肝細胞發生壞死及炎癥刺激時肝組織內纖維、結締組織異常增生的病理過程。肝纖維化是繼發于各種形式慢性肝損傷之后組織修復過程中的代償反應[4]，延緩肝纖維化的病程發展對慢性肝炎的治療非常重要[5]。

肝細胞損傷引起的炎癥反應是促成肝纖維化形成的直接因素[6-7]。ALT和AST是國內外應用最為廣泛的反映肝細胞損害的檢測指標，轉氨酶主要存在于肝細胞內。當肝細胞發生炎癥、壞死等損傷及細胞膜損傷時，轉氨酶從高梯度向血中釋放，導致血清轉氨酶升高。因此血清轉氨酶水平是臨床反映肝細胞損傷的敏感指標。本實驗結果表明，與模型組比較，各給藥組大鼠血清ALT、AST含量明顯下降，提示復方鱉甲軟肝片及肉蓯蓉苯乙醇苷類成分提取物具有保護肝細胞作用。

在肝纖維化發生、發展過程中肝細胞的病理變化復雜，涉及肝細胞損傷(變性、壞死)、炎性、慢性持續的損傷修復反應、氧化應激反應及相關遞質的調控，同時與肝竇內皮細胞、細胞外間質的功能紊亂和交互作用有關。如能有效保護肝細胞，防止肝細胞脂肪變性、壞死，即可阻止炎細胞浸潤和纖維組織增生，從而切斷向肝纖維化、肝硬化發展的病理過程[8]。本實驗用尾靜脈注射BSA建立免疫性肝纖維化模型，其主要原理是異種血清進入機體引發免疫應答，在肝臟主要是在門靜脈匯管區形成免疫復合物沉積，沉積的免疫復合物引起局部炎癥反應，激發各種細胞因子的產生，肝星狀細胞轉變為肝纖維母細胞，分泌大量細胞外基質，發生纖維化[9-10]。本實驗研究結果顯示，肉蓯蓉苯乙醇苷類成分提取物高、中、低劑量均能顯著降低模型大鼠肝、脾臟指數，表明肉蓯蓉苯乙醇苷類成分提取物能顯著改善肝、脾充血、腫大，減輕肝、脾損傷。本研究病理組織學觀察結果顯示，肉蓯蓉苯乙醇苷類成分高、中劑量組病理組織切片肝組織形態基本上接近于正常對照組，減輕肝細胞變性及炎性細胞浸潤，抑制膠原纖維的合成與沉積，提示肉蓯蓉苯乙醇苷類成分對BSA所致肝纖維化大鼠具有一定的防治作用，但其作用機制還需要進一步探討。

參考文獻：

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(本文編輯施洋)