FISH檢測孕早期胚胎停育和自然流產絨毛染色體異常的應用研究

FISH檢測孕早期胚胎停育和自然流產絨毛染色體異常的應用研究

付娟娟1， 楊晨晨2， 胡小萍1

(1新疆維吾爾自治區人民醫院病理科, 烏魯木齊830000;2新疆醫科大學, 烏魯木齊830011)

摘要：目的探討熒光原位雜交(FISH)技術診斷孕早期胚胎停育和自然流產絨毛染色體異常的臨床應用價值。方法采用7種探針,應用FISH技術針對13、16、18、21、22號和X、Y染色體，對60例孕早期胚胎停育和自然流產絨毛組織進行檢測分析,同時用30例人工流產絨毛作為對照。結果60例孕早期胚胎停育和自然流產絨毛組織中32例存在染色體數目異常，檢出率為53.33%，其中15例16-三體，5例13-三體，4例22-三體，1例21-三體，10例三倍體。30例人工流產絨毛組織中檢出染色體數目異常1例，為16-三體，檢出率為3.33%，孕早期胚胎停育和自然流產絨毛組織染色異常檢出率明顯高于人工流產絨毛組織染色體異常，差異有統計學意義(P<0.05)。結論染色體數目異常是導致孕早期胚胎停育和自然流產的主要因素，其中16號染色體三倍體是主要改變，FISH技術可以快速、簡便地檢測出流產絨毛組織染色體異常。

關鍵詞：早期胚胎停育； 自然流產； 染色體異常； 熒光原位雜交

中圖分類號：R365文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.023

[收稿日期：2014-09-21]

基金項目：新疆醫科大學創新基金(XJC2013124)

作者簡介：郭莉(1979-)，女，碩士，主治醫師，研究方向：婦產科超聲診斷,E-mail：1476336277@qq.com。

A clinical research on chromosomal abnormality in early embryo damage and

spontaneous aborted fetuses detected by fluorescent in situ hybridization

FU Juanjuan1, YANG Chenchen2， HU Xiaoping1

(1DepartmentofPathology,ThePeople’sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,

Urumqi830000，China;2XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the application value of detection the chromosome abnormalities of chorionic villi tissue of early embryo damage and spontaneous abortion by fluorescent in situ hybridization technology. MethodsSeven probes were used to detect 13, 16, 18, 21, 22 and X, Y respectively，and sixty cases of early embryo damage and spontaneous aborted fetuses chorionic villus were analyzed by FISH, and the results were compared with villi tissue from 30 cases of artificial abortion. ResultsThirty two of the sixty cases were found chromosomal numerical aberrations，and the detection rate was 53.33%, including fifteen cases of 16-trisomy, five cases of 13-trisomy, four cases of 22-trisomy, one case of 21-trisomy and ten cases of triploidy． One of the thirty cases of artificial abortion were found chromosomal numerical aberrations，and the detection rate was 3.33%, which was much lower than that of early embryo damage and spontaneous abortion group. The difference has statistical significance (P<0.05). ConclusionChromosomal numerical aberrations are the major factors for early embryo damage and spontaneous abortion, and the major change occurred in 16-trisomy. FISH analysis is a rapid and easy method in the detection of chromosomal abnormality in chorionic villus．

Key words: early embryo damage；spontaneous abortion; chromosome abnormality; fluorescent in situ hybridization

胚胎停育的發病原因有遺傳因素、內分泌因素、感染、環境及其他因素。胚胎停育而引起的自然流產約占全部妊娠的10%～20%[1]，染色體異常被認為是胚胎停育及早期流產的主要原因。熒光原位雜交(FISH)技術作為一種近年興起的生物學診斷技術已被廣泛應用，其可以對染色體非整倍體進行快速準確地檢測。本研究應用FISH技術，對60例孕早期胚胎停育和自然流產的絨毛以及30例人工流產的絨毛進行檢測分析，探討FISH技術檢測早期胚胎停育和自然流產絨毛中染色體異常的應用價值。

1資料與方法

1.1研究對象選擇2011年3月-2012年3月胚胎停育患者30例和自然流產患者30例及無異常人工流產絨毛30例，剔除子宮腫瘤、感染、外傷等明確流產誘因者。胚胎停育和自然流產孕婦平均年齡30歲，妊娠時間7～14 w，人工流產婦女平均年齡28歲，妊娠時間5～12 w。均行無菌操作清宮術，術后取絨毛組織進行FISH檢測。

1.2主要儀器與試劑熒光顯微鏡、普通光學生物顯微鏡、熒光光源(Olympus公司)，離心機，電熱恒溫水浴箱，電子分析天平、烤片機(上海醫療器械設備廠)。緩沖液、DAPI復染劑(北京金菩嘉公司)，RNase A、胃蛋白酶、鹽酸、膠原酶B(Sigma公司)，甲醇、冰乙酸、氯化鉀、檸檬酸鈉(北京化學試劑廠)。FISH 13、16、18、21、22、X、Y探針試劑盒(北京金菩嘉公司)。

1.3方法

1.3.1絨毛組織處理取流產絨毛組織，用生理鹽水漂洗后剪碎，加入0.075 mol/L KCl 5 mL,37℃低滲20 min，再加入2 mL固定液(3∶1 甲醇∶冰醋酸)，吹打混勻后離心10 min，棄上清再固定2次，離心后去上清加入1 mL 冰醋酸消化后制備成細胞懸液，滴片。

1.3.2玻片制備將絨毛組織滴片后玻片室溫干燥，于室溫下2×SSC(緩沖液)溶液中漂洗5 min，0.08 mg/mL胃蛋白酶中37℃消化5 min，消化后依次置于70%、85%、100%乙醇中脫水各3 min，室溫干燥。

1.3.3FISH檢測按試劑盒提供的熒光原位雜交操作說明書進行操作，42%保溫箱中過夜、洗片、復染后在熒光顯微鏡下觀察。

1.4結果判讀16號染色體(紅色)/22號染色體(綠色)探針，正常細胞為2個紅色、2個綠色信號；13號染色體(綠色)/21號染色體(紅色)探針，正常細胞為2個紅色、2個綠色信號；18號染色體(藍色)/X染色體(綠色)/Y染色體(紅色)，正常男性細胞中顯示1個紅色信號、1個綠色信號、2個藍色信號，正常女性顯示2個綠色信號、2個藍色信號。每張玻片計數至少100個細胞，單獨判斷每種指標：正常細胞比例>90%，提示該指標正常；某指標異常細胞>60%，提示該指標異常；如正常細胞比例<90%且異常細胞比例<60%，則擴大計數至200個細胞。

2結果

90例流產絨毛組織，FISH成功率為100%。60例胚胎停育和自然流產絨毛組織中檢出染色體數目異常32例，檢出率為53.33%，其中15例16-三體(圖1)，5例13-三體(圖2),4例22-三體，其中1例13、16、21、22號染色體均有3個雜交信號(圖3)，10例三倍體，FISH檢測染色體異常見表1。人工流產絨毛組織30例，檢出染色體數目異常1例，為16-三體，檢出率3.33%。胚胎停育和自然流產絨毛與人工流產絨毛染色體異常檢出率差異有統計學意義(P<0.01)。

圖116-三體 16號染色體(紅色)/22號染色體(綠色)探針

圖213-三體 13號染色體(綠色)/21號染色體(紅色)探針

圖316-三體、22-三體 16號染色體(紅色)/22號染色體(綠色)探針

3討論

胚胎停育和自然流產一直是復雜的婦產科常見病，約占全部妊娠的12%～23%[1]。幫助胚胎停育和自然流產夫婦找到妊娠失敗的原因可有效指導患者下一次成功妊娠，減輕其心理負擔。胚胎停育和自然流產病因復雜，其中染色體異常被認為是胚胎停育和早期流產的主要原因[2-3]。

表1　FISH檢測染色體異常類型

注: 其中有1例16、13、22、21號染色體均為三體。

染色體核型分析技術可以準確檢測染色體結構和數目的異常，是目前染色體檢測的金標準，但其缺點是檢測方法繁瑣、技術要求高、廣泛普及難度大，而且其對標本要求高，需要足夠的活性細胞和無菌條件，對于胚胎停育患者，若胚胎死亡時間較長，可能因無活性細胞而導致培養失敗，成功率為91%～98%[4]。另外，核型分析檢測時間長，一般需2～3 w，不能適應臨床快速診斷要求。

目前熒光原位雜交(FISH)技術用于檢測胚胎停育和自然流產絨毛組織13、16、18、21、22、X和Y染色體，其針對的是未經培養的細胞，對標本的要求較低，對于無活性的細胞和污染的標本也可以進行檢測，而且FISH技術的操作相對簡單，需要時間短，24 h就可得到檢測結果，并且FISH檢測的特異性及敏感性都較好。

本研究顯示,FISH檢測成功率為100%，染色體異常檢出率為53.33%，與文獻[5-7]報道的結果一致。說明FISH方法可以有效地檢出大部分染色體數目異常導致的孕早期流產及胚胎停育。而人工流產絨毛組織的檢出率僅為3.33%，兩者差異有統計學意義，表明染色體異常是胚胎停育和自然流產的主要原因。本研究中染色體異常以16-三體最常見，占所有染色體異常的46.88%，該結論與Baffero等[8]報道的16-三體的染色體異常是早期胚胎停育和自然流產的主要原因結果一致。染色體數目改變的主要原因是雙親之一的配子時或妊娠初期受精卵分裂時出現了染色體的不分離，而導致該染色體增加或減少了1條，而三倍體甚至是四倍體在流產胎兒中也較常見，這種染色體的異常可以源自新的突變或雙親之一的配子形成中的異常有絲分裂或精母細胞、卵母細胞減數分裂中異常，也可源自雙受精等，這類染色體異常一般在孕8 w以前流產。

FISH技術優勢較明顯，可以彌補“ 金標準”染色體核型分析的不足，臨床應用前景十分廣闊 ，但其在檢測染色體方面的缺陷是不容忽視的，最主要是其漏診率較高，由于FISH探針是針對最常發生數目異常的染色體進行設計的，現階段只能針對13、16、18、21、22、X/Y 6種常見的染色體數目異常信號進行診斷，不能對整個染色體組進行分析，如果是上述6種染色體之外的染色體數目異常，則不能檢測而出現漏診。另外目前用于FISH 檢測的探針屬于著絲粒探針，該類探針只能檢測染色體數目異常，對染色體的結構改變不能做出診斷而出現漏診[9-10]。所以目前FISH技術還不能完全取代核型分析技術，可建議患者核型分析聯合FISH檢測同時進行，二者的技術互補可彌補彼此的不足。

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(本文編輯楊晨晨)