阻斷鈣激活鉀通道對宮頸癌細胞增殖及鉀通道電流的影響

·論著·

阻斷鈣激活鉀通道對宮頸癌細胞增殖及鉀通道電流的影響

劉玲，聶丹，范凌曄，詹平，錢燕萍，毛熙光

(瀘州醫學院附屬醫院，四川瀘州646000)

摘要：目的觀察鈣激活性中電導鉀離子通道(IKCa1)被阻斷后對宮頸癌HeLa細胞增殖及IKCa1膜電位的影響。方法分別用IKCa1阻斷劑克霉唑和RNA干擾法阻斷HeLa細胞的IKCa1后，用RT-PCR技術檢測HeLa細胞的IKCal mRNA，MTT法檢測細胞OD值，膜片鉗技術檢測細胞IKCa1電流。結果克霉唑阻斷IKCa1后，HeLa細胞的IKCa1 mRNA表達降低、IKCa1電流減弱、細胞OD值下降，與對照組相比，P均<0.05。RNA干擾法阻斷IKCa1后，Hela細胞的IKCa1 mRNA表達下降、IKCa1電流減弱、細胞OD值降低，與空白對照組和陰性轉染組相比，P均<0.05。結論 阻斷IKCa1能有效抑制HeLa細胞增殖，下調細胞IKCa1 mRNA的表達，降低其IKCa1電流；IKCa1通過調控HeLa細胞膜電位而影響其信號傳遞，調控HeLa細胞的增殖。

關鍵詞：離子通道；鉀離子通道；鈣激活性中電導鉀離子通道；鉀離子通道阻斷劑；克霉唑；小分子干擾RNA技術；宮頸癌細胞；HeLa細胞株

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.001

中圖分類號：R737.33文獻標志碼：A

基金項目：四川省科技廳應用基礎研究基金資助項目(2008JY0014-1)；四川省衛生廳科研基金資助項目(110373)；四川省瀘州市科技局科研項目(2013LZLY-J30)。

作者簡介：第一劉玲(1981-)，女，碩士，主治醫師，主要研究方向為婦科腫瘤、生殖內分泌。E-mail: eye99@163.com

作者簡介：通信毛熙光(1965-)，男，碩士，教授，主要研究方向為婦科腫瘤。E-mail: mxg6639@163.com

收稿日期：(2015-07-07)

Effects of blocking intermediate-conductance-Ca2+-activated K+channels

on proliferation of cervical cancer cells and potassium channel current

LIULing,NIEDan,FANLing-ye,ZHANPing,QIANYan-ping,WANGChun-yan,MAOXi-guang

(TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzou646000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of blocking intermediate-conductance-Ca2+-activated K+ channels (IKCa1) on the cell proliferation and the membrane potential changes of IKCa1 in cervical cancer HeLa cells. MethodsIKCal of HeLa cells was blocked with IKCa1 channel inhibitor (clotrimazole, CLT) and RNA interference, respectively. RT-PCR was used to detect the expression of IKCal mRNA in HeLa cells. The OD value of cells was detected by MTT, and IKCal current was detected by the patch clamp technique in HeLa cells. ResultsWhen IKCal was blocked with CLT in HeLa cells, the expression of IKCal mRNA was decreased, IKCal current wakened and the OD value of cells decreased as compared with that of the control group (all P<0.05). When IKCal was blocked by small interfering RNA technology in HeLa cells, the expression of IKCal mRNA reduced, IKCal current wakened, and the OD value of cells decreased as compared with that of the blank group and negative transfection group (all P<0.05). ConclusionsBlocking IKCa1 could inhibit cell proliferation, down-regualte the expression of IKCa1 mRNA and cut down the IKCal current in HeLa cells. IKCa1 could regulate the cell proliferation of HeLa cells by directly regulating the membrane potential and thus affecting its signal transmission.

Key words: ion channel; potassium channel; intermediate-conductance-Ca2+-activated K+channels; potassium channel blocker; clotrimazole; small interfering RNA technology; cervical carcinoma cells; HeLa cell line

目前，宮頸癌的發病機制尚不明確。離子通道是一種成孔蛋白，它通過允許某種特定類型的離子依靠電化學梯度穿過該通道，幫助細胞建立和控制質膜間的微弱電壓差，以維持細胞調控信息的正常表達和傳遞，這些離子通道存在于所有細胞的細胞膜上[1～3]。離子通道包括鉀離子通道家族、氯離子通道家族、鈣離子通道家族、質子通道家族等。其中鉀離子通道的功能異常在腫瘤細胞的生長繁殖過程中發揮了重要作用。在人類子宮內膜癌、乳腺癌、膀胱癌、結腸癌、膠質母細胞瘤中均發現有鈣激活性中電導鉀離子通道(IKCa1)蛋白的高表達[4，5]。我們的前期研究[6]也發現，宮頸癌組織和細胞中IKCa1蛋白呈高表達。2012年2月，我們采用小分子干擾RNA(shRNA)技術和鉀離子通道阻斷劑克霉唑阻斷IKCa1后觀察了宮頸癌HeLa細胞的增殖情況及其IKCa1膜電位的變化。現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1主要材料宮頸癌細胞株HeLa由重慶醫科大學病理學實驗室惠贈，培養于含10%小牛血清的RPMI1640培養基中。pGenesil-1.1質粒、大腸桿菌菌株DH5α購自武漢晶賽生物技術工程有限公司；質粒pGenesil-IK1、質粒pGenesil-IK2、質粒pGenesil-HK由作者所在實驗室構建。

1.2HeLa細胞IKCa1的阻斷、IKCa1 mRNA檢測、增殖情況觀察、IKCa1電流檢測方法

1.2.1HeLa細胞IKCa1的克霉唑阻斷、IKCa1 mRNA檢測、增殖情況觀察、IKCa1電流檢測方法將鉀離子通道阻斷劑克霉唑干粉用無水乙醇和含10%小牛血清的RPMI1640培養液配制，終濃度分別為5、10、20、40 μmol/L。將HeLa細胞調整密度為1×105/mL的細胞懸液。取100 μL細胞懸液接種至96孔培養板，培養24 h后棄培養液，分別加入5、10、20、40 μmol/L的克霉唑制劑180 μL(分別為實驗1、2、3、4組)；另取同樣密度的HeLa細胞懸液加入含等量無水乙醇的無克霉唑培養液180 μL(對照組)；每組6孔，繼續培養，分別于培養24、48、72 h時，用RT-PCR法檢測細胞的IKCa1 mRNA：TRIzol提取各組細胞總RNA，逆轉錄生成cDNA。以cDNA為模板、GAPDH為內參照擴增IKCa1。IKCa1擴增引物:上游 5′-GTGCGTGCAGGATTTAGGG-3′，下游5′-TGCTAAGCAGCTCAGTCAGGG-3′，擴增片段為856 bp；GAPDH擴增引物:上游5′-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3′，下游5′-GGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′，擴增片段為263 bp。擴增條件：94 ℃預變性4 min,加Tat/酶，94 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循環30次，終延伸72 ℃ 10 min。反應產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，分析并檢測各電泳條帶的積分光密度，結果以IKCa1 mRNA與GAPDH mRNA的積分光密度比值表示。在上述相同時間點、用MTT法檢測細胞OD值。

取HeLa細胞，胰蛋白酶消化，調整細胞密度為2×105/mL，接種于培養瓶，用RPMI1640完全培養液培養24 h后分組(對照組、實驗組)并分別加入無克霉唑培養液、含克霉唑培養液(克霉唑濃度為20 μmol/L)，繼續培養48 h，PBS沖洗。收集細胞制備單細胞懸液，用膜片鉗技術檢測其IKCa1電流：將膜片鉗的電極輕壓到細胞表面進行負壓抽吸，使之形成1～4 GΩ高阻封接，破膜后補償串聯電阻及抵消電容電流，形成全細胞記錄形式。信號經膜片鉗放大器( EPC29，HEKA)放大,用Axon “pCLAMP”(美國)采集、分析數據。

1.2.2HeLa細胞IKCa1的shRNA技術阻斷、IKCa1 mRNA檢測、增殖情況觀察、IKCa1電流檢測方法選取我們前期成功構建的pGenesil-1.1- IKCa1 shRNA(干擾序列)、pGenesil-1.1-HK(陰性對照序列)重組質粒載體，用LipofectamineTM2000脂質分別轉染HeLa細胞，并將細胞分為pGenesil-IKCa1 shRNA組(轉染組)、pGenesil-HK組(陰性對照組)，另設HeLa細胞對照組(空白對照組)，繼續培養，分別于培養24、48、72 h時，用RT-PCR法檢測HeLa細胞的IKCa1 mRNA(方法同上),MTT法檢測細胞OD值。取培養48 h時的細胞，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白以判斷轉染情況并篩選出轉染陽性細胞，用膜片鉗技術檢測其IKCa1電流：取各組轉染陽性HeLa細胞，接種于多聚賴氨酸載玻片上，37 ℃孵育1 h，選擇形態正常、大小中等的細胞為實驗樣本，IKCa1電流檢測方法同上。

2結果

2.1克霉唑阻斷IKCa1的HeLa細胞IKCa1 mRNA表達、增殖情況、IKCa1電流變化

2.1．1克霉唑阻斷IKCa1的HeLa細胞IKCa1 mRNA表達變化不同時間點各組HeLa細胞IKCa1 mRNA的表達見表1。由表1可見，隨克霉唑濃度增加和作用時間延長，實驗1、2、3、4組HeLa細胞IKCa1 mRNA的表達水平明顯下降；各時間點組間相比，P均<0.05；實驗1、2、3、4組與對照組相比，P均<0.05。

2.1.2克霉唑阻斷IKCa1的HeLa細胞OD值變化不同時間點各組HeLa細胞OD值見表2。由表2可見，實驗1、2、3、4組HeLa細胞OD值逐漸降低；各時間點組間相比，P均<0.05；實驗1、2、3、4組與對照組相比，P均<0.05。

表1　 不同時間點各組HeLa細胞IKCa1 mRNA的

表2　不同時間點各組HeLa細胞OD值

2.1.3克霉唑阻斷IKCa1的HeLa細胞IKCa1電流變化在鉗制膜電位為+60 mV時，對照組及實驗組IKCa1電流分別為(23.07±5.47)、(9.84±4.46)pA/pF，兩組相比，P>0.05。

2.2shRNA技術阻斷IKCa1的HeLa細胞IKCa1 mRNA表達、增殖情況、IKCa1電流變化

2.2.1shRNA技術阻斷IKCa1的HeLa細胞IKCa1 mRNA的表達變化不同時間點各組HeLa細胞IKCa1 mRNA的表達見表3。由表3可見，隨培養時間延長，轉染組HeLa細胞IKCa1 mRNA的表達水平逐漸下降；各時間點轉染組IKCa1 mRNA與陰性對照組和空白對照組相比，P均<0.05；陰性對照組與空白對照組相比，P均>0.05。

表3　 不同時間點各組HeLa細胞IKCa1 mRNA的

2.2.2shRNA技術阻斷IKCa1的HeLa細胞OD值變化不同時間點各組HeLa細胞OD值見表4。由表4可見，各時間點轉染組HeLa細胞OD值降低，與陰性對照組和空白對照組相比，P均<0.05；陰性對照組和空白對照組各時間點的OD值相比，P均>0.05。

表4　不同時間點各組HeLa細胞OD值

2.2.3shRNA技術阻斷IKCa1的HeLa細胞IKCa1電流變化在鉗制膜電位為+60 mV時，空白對照組、陰性對照組、轉染組IKCa1電流分別為(21.25±4.67)、(21.3±5.51)、(10.93±4.4)pA/pF，轉染組與空白對照組和陰性地照組相比，P均<0.05；空白對照組和陰性地照組相比，P>0.05。

3討論

IKCa1作為鉀離子通道家族中的一個重要組成部分，通過調節細胞內鈣離子濃度和調節細胞膜電位，參與了細胞的多種生物學活動，如細胞因子的分泌、電解質的轉運、滲透壓的維持、細胞遷移及增殖等生理活動[7～9]。IKCa1的基因活化、增強表達、通道開放和電壓強度變化、通道密度參數等都影響腫瘤細胞的增殖，這表明IKCa1與惡性腫瘤的發生及發展密切相關[10,11]。Susumu等[12]研究發現，人前列腺增生組織中IKCa1蛋白高表達，IKCa1抑制劑可抑制前列腺組織的增生。Joanne等[13]研究發現，IKCa1調控人胚胎腎HEK293細胞的增殖，阻斷IKCa1通道能抑制HEK293細胞增殖，而IKCa1表達的細胞增殖能力增強，IKCa1對HEK293細胞增殖的調控可能是通過ERK1/2和JNK信號途徑共同作用完成的。

克霉唑作為已知的IKCa1阻斷劑已被廣泛應用[14]。本研究用克霉唑干預HeLa細胞后，細胞IKCa1 mRNA的表達水平下降、IKCa1電流減弱，表明克霉唑能有效阻斷HeLa細胞IKCa1通道。此外，本研究將IKCa1干擾質粒轉染HeLa細胞，細胞IKCa1 mRNA的表達水平下降、電流減弱，表明IKCa1基因下調能有效阻斷HeLa細胞IKCa1通道。本研究用克霉唑及shRNA技術阻斷IKCa1后，隨克霉唑濃度升高和作用時間延長，對HeLa細胞生長的抑制作用也增強。可見阻斷IKCa1，細胞增殖受到明顯影響。張英麗等[15]研究發現，KCa3.1的相對特異性阻斷劑TRAM-34明顯影響子宮內膜癌細胞株HEC1-A 和Ishikawa的增殖，且呈劑量及時間依賴性；應用RNA干擾技術可抑制HEC-1-A和Ishikawa細胞株中KCa3.1的蛋白表達并抑制細胞的增殖。Haren等[16]通過免疫組化、PCR等生物學手段和膜片鉗技術研究發現，IKCa1在乳癌組織和乳腺癌細胞中的表達升高，IKCa1 mRNA和蛋白表達水平也升高,并且升高幅度與腫瘤的期別、分化程度及轉移密切相關。我們的前期研究發現[6],宮頸癌組織中IKCa1 mRNA表達明顯高于正常宮頸組織，本研究發現IKCa1基因被阻斷和沉默后HeLa細胞IKCa1 mRNA的表達也明顯降低、IKCa1電流減弱，可能是IKCa1通道被阻斷以及IKCa1基因被沉默后，細胞的電位和能量轉運受到影響，細胞的滲透壓發生改變，細胞失水，其物質代謝和生長代謝受到影響，使細胞不能獲得足夠的營養，繼而出現功能紊亂而發生壞死、崩解，細胞數量明顯減少。這與De Marchi等[17]研究發現的IKCa1對細胞線粒體的影響一致。

綜上所述，阻斷IKCa1能下調Hela細胞IKCa1 mRNA的表達，有效抑制HeLa細胞增殖，降低其IKCa1電流。IKCa1通過調控HeLa細胞膜電位而影響其信號傳遞，調控HeLa細胞的增殖。在深入探討IKCa1的作用機制及其對細胞生長調控的基礎上，研究開發具有對宮頸癌特異性的抑制IKCa1活性或表達的藥物，將有助于宮頸癌的治療。

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