湖北不同地區甘薯蔓割病病原菌的分離與分子鑒定

雷劍　王連軍　楊新筍　蘇文瑾　柴沙沙

摘要：2011～2014年分別從湖北省甘薯主產區十堰市、武漢市、宜昌市等地分別采集了甘薯蔓割病（Fusarium bulbigenum）發病典型植株，在實驗室分離純化并培養，并對分離得到的真菌核糖體基因轉錄間隔區進行測序分析。測序結果顯示目的片段長度為544 bp，武漢和宜昌的序列完全一致。從十堰擴增出來的序列的385位置是C而武漢和宜昌擴增的結果該位置是T，說明引起湖北省甘薯蔓割病的甘薯鐮孢菌存在多態性。

關鍵詞：甘薯；甘薯蔓割病（Fusarium bulbigenum）； 病原菌； 分離； 分子鑒定

中圖分類號：S432.4+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）24-6235-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.034

Abstract： From the city of Shiyan， Wuhan， Yichang， 3 Fusarium bulbigenum pathogens were separated and purified. by Molecular identified F. bulbigenum from different regions of Hubei province. The test results showed that the length of the target fragment was 544 bp， and the sequence of Wuhan and Yichang was the same. From Shiyan amplified sequence of 385 position was C and Wuhan and Yichang amplification results of the location was T， molecular indicating that the F. bulbigenum from different regions of Hubei province presenced polymorphism.

Key words： sweetpotato； Fusarium bulbigenum； pathogenicity； isolation； molecular identification

甘薯具有高產、穩產、適應性廣、抗逆性強、營養豐富、用途廣泛等特點，是中國僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物[1，2]。甘薯蔓割病又稱鐮刀菌枯萎病（Fusarium bulbigenum），是中國南方甘薯產區的一種主要真菌性病害，近年來有向長江中下游區域蔓延的趨勢，根據2011年以來湖北省甘薯主產區主要甘薯病害調查結果顯示，十堰市、武漢市、荊州市及宜昌市均發現了甘薯蔓割病的危害，部分田塊發病率高達30%以上。該病在田間隨機分布，一般減產10%～20%，重者達50%以上，對甘薯高產、穩產威脅極大[3]。為此，本研究通過采集湖北省甘薯主產區十堰市、武漢市及宜昌市的蔓割病病樣，分離培養各地區采集的蔓割病病原菌樣本，鑒定各地區蔓割病病原菌的致病力差異，分析其表型及分子水平上的差異，為指導各地區蔓割病的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

蔓割病病原菌為2011～2014年間在湖北省甘薯主產區十堰市、武漢市、宜昌市等地分離純化得到的蔓割病病原菌菌株，依次命名為SY菌株、WH菌株及YC菌株。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離 將發病植株清洗干凈，取病健交界處莖段0.5 cm，剝去外皮，清洗。在超凈工作臺上用消毒的解剖刀切成0.2 cm×0.3 cm的小塊，放入75%的乙醇中消毒3 min，移至5%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，取出用無菌水沖洗3次，用滅菌的濾紙吸干水分，接種在PDA培養基上，28 ℃培養2 d左右，觀察有無絲狀物出現[4-7]。

1.2.2 病原菌純化培養 在超凈工作臺上用滅菌的挑菌針挑取菌絲轉移到空的PDA培養基上。28 ℃培養2 d左右，觀察有無雜菌，如有雜菌繼續重復上述工作，直到PDA培養基中只有單一的蔓割病病原菌菌絲為止。

1.2.3 病原菌形態學觀察 在載玻片上滴一滴乳酸棉蘭染色劑，用接種針挑一點菌絲，分散在染色液當中，蓋上蓋玻片，排氣泡，2 min左右放到光學顯微鏡下100倍觀察，比較不同區域采集分離的病原菌在形態學上是否存在差異。

1.2.4 分子鑒定 對分離得到的甘薯鐮孢菌核糖體基因轉錄間隔區進行測序分析，研究湖北省甘薯鐮孢菌的多態性。利用PDA培養基對待檢菌體進行培養（28 ℃，48～72 h），收獲菌絲體以備核酸提取、真菌DNA基因組提取、核酸純度和濃度檢測、rDNA-ITS 擴增，rDNA-ITS測序與分析。

2 結果與分析

通過分離純化獲得了十堰市、武漢市、宜昌市3個地區的甘薯蔓割病病原菌分離物，并對3個地區的蔓割病病原菌進行了顯微鏡檢，結果顯示為鐮刀菌屬，且各地區的病原菌在形態上差異并不明顯（圖1）。

對3個地區分離得到的真菌核糖體基因轉錄間隔區進行測序分析。測序結果如下：TCCGTAGG

T GAACCT GCG GAGGGAT CAT TACCGAGT T TACAA

C T CCCA AACCCC T GT GAACATACCACT T GT TGCCT

C GCGGA TCAGCCCGC T CCCGGT AAAACGGGACG G

CCCGCCAGAGGACCCC T AAACTCTG T T T CTATAT G

TAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAA

C T T T CAACAACGGA T C TCT T GG T TCTGGCATCGAT

G AAGAA CGC AGC AAA ATGC GAT AAG TAA TGT GA

ATTGCAGAAT TCAGT GAAT C ATCGAATCT T TGAAC

GC AC AT TGCG CCC GCC AG TA T T CTG GCGG GCAT G

CCTGTTCGAGCGTCA T T TCA ACCC TCAAGCACA GC

TTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAA

ATTGATTGGCGGTCACGTCGAGC T T CCAT AGC GTA

G TA GT AAAACCC T CG T TAC TGG TAA TCG TC GCGG

CCACG CCG T TAAAC CCCA ACTTCTGAATGT TGACC

TCGGAT CAGG TAG GAAT AC CCGC T GAAC T T AAGC

ATATCAATAAGCGGAGGA。

目的片段長度為544 bp，武漢市和宜昌市的序列完全一致。從十堰市擴增出來的序列的385位置是C，而武漢市和宜昌市擴增的結果該位置是T，說明引起湖北省甘薯蔓割病的甘薯鐮孢菌存在多態性。

3 小結與討論

試驗結果表明，十堰市、武漢市、宜昌市3個地區的甘薯蔓割病病原菌100倍顯微結果顯示為鐮刀菌屬，且各地區的病原菌在形態上并無明顯差異。通過對3個地區分離得到的真菌核糖體基因轉錄間隔區進行測序分析表明，目的片段長度為544 bp，武漢市和宜昌市的病原菌真菌核糖體基因轉錄間隔區序列完全一致。但是從十堰市擴增出來的序列的385位置是C，而武漢市和宜昌市擴增的序列該位置是T，說明引起湖北省甘薯蔓割病的甘薯鐮孢菌在分子水平上存在多態性。這個多態性也許會導致不同區域分離的病原菌具有不同的致病力。后續將開展人工接種抗病鑒定試驗，確定3個地區分離病原菌致病力的差異，以驗證分子水平上的差異是否會帶來致病性上的差異。

參考文獻：

[1] 福建莆田地區農科所，平潭縣農技站.甘薯蔓割病的發生規律與防治[J].福建農業科技，1978（2）：27-32.

[2] 方樹民，陳玉森.福建省甘薯蔓割病現狀與研究進展[J].植物保護，2004，30（5）：19-22.

[3] 小川奎，褚茗莉.甘薯蔓割病的防治[J].雜糧作物，1984（1）：56.

[4] 方樹民，陳玉森，鄭光武.甘薯主栽品種對甘薯瘟和蔓割病抗性評價[J].植物保護，2002，28（6）：23-25.

[5] 柯玉琴，潘廷國，伍迪明，等.甘薯抗蔓割病的生理機制I.感染蔓割病后甘薯葉片脂質過氧化及保護酶的變化[J].福建農業大學學報，1994，23（1）：112-116.

[6] 柯玉琴，潘廷國.甘薯抗蔓割病的生理機制II.甘薯抗蔓割病與多酚氧化酶及其同功酶的關系[J].福建農業大學學報，1996， 25（3）：377-380.

[7] COLLINS W W，NIELSEN L W. Fusarium wilt resistance in sweet potatoes[J].Phytopathology，1976，66（4）：489-493.