ISSR分子標記技術在家蠶遺傳研究上的應用進展

吳凡　李德臣　趙春曉　陳登松

摘要：概括了ISSR 分子標記技術的基本原理和特點，綜述了其在家蠶相關領域中應用的研究進展，并展望了其在家蠶遺傳研究上的應用前景。

關鍵詞：家蠶；ISSR；遺傳研究；應用

中圖分類號：S881.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）24-6124-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.004

Abstract： The basic principle and characteristics of Inter-simple Sequence Repeat （ISSR） was described. The application of ISSR in silkworm genetics was summarized. The application future in the study of silkworm was prospected.

Key words：silkworm；ISSR；genetics research； application

家蠶作為一種重要的經濟昆蟲，成為研究遺傳、發育、生理、藥代動力學等生物科學研究中理想的研究對象。常規的形態學標記在家蠶品種選育和鑒定等方面起到了一定的作用，但是很易受到內外環境條件的影響。隨著分子標記技術的迅速發展，加錨微衛星重復序列（Inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR）分子標記技術越來越多地被應用于家蠶的遺傳多樣性分析、基因定位及系統分類研究中。本文對 ISSR 分子標記技術的基本原理和特點及其在家蠶相關領域中的研究進展進行了綜述，并展望了其在家蠶遺傳研究上的應用前景，希望能對家蠶資源的研究及保存、鑒定和利用提供一定的參考。

1 ISSR分子標記技術基本原理和特點

1.1 ISSR分子標記技術的基本原理

ISSR分子標記方法是Zietkiewicz在微衛星技術（Simple sequence repeat，簡稱SSR）的基礎上建立起來的一種新型分子標記技術[1]，根據其所使用的引物是否在3′端或5′端加錨定堿基可以分為錨定簡單重復序列間擴增（Anchoredinter-simple sequence repeat，簡稱ASSR）和非錨定簡單重復序列間擴增（Nonamchored inter-simple sequencerepeat，簡稱MP-PCR）。ASSR是在微衛星寡核苷酸引物的3′端或5′端加上2～4個隨機選擇的核苷酸，引起特定位點退火，保證引物與基因組DNA中SSR的3′端或5′端結合[2]，擴增重復序列間的片段。MP-PCR是直接以寡核苷酸引物進行PCR擴增，擴增重復片段和重復序列間的片段。擴增出來的條帶可通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，從而獲得指紋圖譜。

1.2 ISSR分子標記技術的特點

ISSR分子標記技術來源于SSR分子標記技術，因此具有SSR分子標記的優點，可在基因組上進行擴增，可以快速、準確和高效地檢測出位于基因組DNA上的多態性，適用物種范圍廣，可以揭示不同SSR座位個體間的變異信息，提供多位點信息[3-5]，成本較低， 重復性好， 操作簡單，非常適合于對大樣本進行檢測，而且該技術相比較于SSR技術，因為采用的引物序列比較長，其遺傳多態性比較高，也同時提高了試驗結果的可靠性。目前，ISSR分子標記技術在種群遺傳學、種質資源、分類學與種系發生學等方面得到迅速應用[6-8]。

2 ISSR分子標記技術在家蠶遺傳研究上的應用

2.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性作為生物多樣性的一個重要組成部分，是種群繁殖和更新換代的基礎，可反映出物種對不用環境的適應能力，以及在環境的變化和變遷中所具有的持續計劃的潛力[9]。ISSR分子標記能夠揭示物種基因組內的多態性位點，是一種研究種群內及種群間遺傳多樣性的理想方法之一[10]。

Li等[11]證明了ISSR分子標記能夠運用于家蠶遺傳多樣性分析，他們采用ISSR的方法，對42個家蠶品種進行擴增，有12條引物能擴增出清晰條帶108條，其中多態性條帶85個，且重復性較好，通過聚類分析，將這些品種分為7個亞群。房守敏等利用ISSR技術分析了6個家蠶品種和2個不同地域的野桑蠶群體的遺傳多樣性，6條ISSR引物共檢測到66個位點，其中65個多態性位點，并根據遺傳距離進行了聚類分析。Nagaraju等[12]采用ISSR技術對13個不同品種蠶的遺傳多態性進行了分析。Pan等[13]采用ISSR技術分析了9個家蠶細胞培養系的多態性，26條引物擴增出797條多態性譜帶，多態率為89.9%。

2.2 資源鑒定及分類

在對家蠶品種資源進行鑒定和分類時，由于其外部特征比較相像，中系一般為素蠶，日系一般為普斑蠶，雖然其大小有差異，但是僅僅根據其形態學，很難將其進行區分和鑒定，但是其個體所攜帶的遺傳信息是不同的，因此可以根據其在基因組DNA上的多態性不同，將其準確地分類鑒定，ISSR 標記技術在家蠶資源的鑒定和分類中是非常有效的，可保證試驗結果的科學性和可靠性。

Reddy等[14]以6條ISSR引物對13個滯育和非滯育家蠶品系進行了遺傳鑒定，發現多態性占總數的77%。Velu等[15]采用ISSR分子標記研究了20個家蠶突變體的遺傳變異關系，用15條引物擴增出113個標記，其中多態性的比率為73.45%，并進行了聚類分析，20個家蠶突變體可以分為6個類群，結果表明該技術是確定突變的家蠶品系之間遺傳變異的一種重要方法。

2.3 指紋圖譜的構建

許多研究已表明，ISSR分子標記技術在研究動物種間、種群間的親緣關系以及動物系統發育方面也取得了很好的效果。Chatterjee等[16]分別采用RFLP和ISSR等分子標記的方法分析了家蠶遺傳學，比較了這兩種方法在家蠶遺傳學研究上的應用，結果表明在指紋圖譜分析中，ISSR分子標記技術更具有優勢。Pan等[17]成功建立了BmE-SWU1和BmE-SU2兩個家蠶細胞系，并獲得了兩個細胞系的ISSR指紋圖譜。endprint

2.4 家蠶分子標記輔助選擇育種

家蠶分子標記輔助選擇（Marker assisted selection，MAS）是利用了遺傳標記與控制數量性狀的基因之間的連鎖關系，在實際選擇育種過程中，利用遺傳標記和表型選擇相結合的方式來代替常規的育種方法，從而選育出具有優良性狀的家蠶實用品種，已成為家蠶優良品種選育過程中的重要方法，ISSR分析也可篩選出與優良表型性狀基因緊密連鎖的DNA片段，使其成為一種能夠輔助育種的分子標記[18]。

Srivastava等[19]用15對引物對15個多化性家蠶品種進行ISSR-PCR分析，聚類分析結果表明這15個品種分成5個類群和1個隔離群，利用多重回歸分析發現其中的5條帶與熱處理后的化蛹率相關，相關性最大的是標記8083000，該標記可以用于以分子標記輔助選擇熱耐受性家蠶品種的DNA標記。Chatterjee等[16]也采用ISSR分子標記的方法篩選了與家蠶發育及生產性狀相關標記。Pradeep等[20]發現有ISSR標記830.8（1 050 bp）與家蠶幼蟲體重、全繭量、繭層量顯著相關，兩個ISSR標記835.5（1 950 bp）和825.9（710 bp）與家蠶幼蟲期顯著相關。

3 ISSR分子標記技術在家蠶遺傳研究上的應用前景

隨著分子生物學的發展，ISSR分子標記技術已經是一個非常成熟的分子標記技術，它所需的設備技術簡單，結果可靠，重復性強、多態性好等，對工作人員無危害。實踐證明，該技術在很多物種例如長序榆[21]、玉米圓斑病菌[22]、石斛[23]、桑樹[24]等，在研究其遺傳多樣性、親緣關系、種質資源的鑒定等方面都得到了廣泛的應用，具有很好的適應性。

家蠶作為一種模式生物和重要的經濟動物，目前在家蠶研究中應用較多的分子標記是AFLP、SSR和RAPD，但是有關ISSR應用于家蠶研究的報道還不多。隨著家蠶基因序測序的完整和基因組數據庫的建立，很多SSR標記被發現和利用，ISSR標記是在SSR標記的技術上發展起來的，使用的引物可以是SSR引物，也可以是加錨的SSR引物，人們應該積極地拓寬該技術在家蠶遺傳研究上應用的深度，特別是在家蠶種質資源的鑒定、遺傳多樣性、親緣關系的分析、抗性育種等方面，積極借鑒在其他動物上成功應用的經驗等，促進家蠶遺傳育種的研究進展，ISSR分子標記技術將在家蠶新組合的早期鑒定中起到非常重要的作用，同時可以縮短育種年限、提高育種工作效率，促進家蠶品種的更新換代。

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