稻瘟病菌孢子的分離和保存方法

趙沙沙　田永宏　余華強　孫永建　曹國長　陳波　房振兵　范兵

摘要：介紹了稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]孢子的分離和保存方法，并加以比較和分析。結果表明，將發病組織進行保濕培養，產孢后用洗耳球將孢子吹到培養基上挑取單一菌落，采用濾紙片法保存，可以很好地分離和保存稻瘟病菌單孢。

關鍵詞：稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]； 單孢； 分離； 保存

中圖分類號：S432.4+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）24-6252-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.040

Abstract： The methods of isolation and preservation of single spore of rice blast fungus were introduced， which were taken into comparison and analysis. The results showed that the diseased tissues were cultured by moisture-retaining， then the spores produced were blown into the plate culture medium to pick a single colony with ear washing bulb and preservated by filter paper method， which could isolate and preservate the single spore of rice blast fungus commendably.

Key words： rice blast fungus[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]； single spore； isolation； preservation

由稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]引起的稻瘟病是世界上水稻三大病害之一，給水稻的產量和質量造成了嚴重的影響。長期的生產實踐證明，選育和種植抗稻瘟病品種是防治稻瘟病最經濟、有效和安全的措施，符合人類對綠色食物的要求[1]。選育抗稻瘟病品種需要在田間對待選材料苗期、分蘗盛期和孕穗初期進行人工接種鑒定，選擇出抗病且大田表現較好的水稻材料，其中關鍵的一個環節就是獲取足夠量的接種體——稻瘟病菌分生孢子。這就需要從發病的水稻標樣上分離得到不同稻瘟病菌株的單孢并加以保存。本研究介紹了稻瘟病菌孢子的一些分離和保存方法，并加以比較和分析，為育種工作者分離和保存稻瘟病菌孢子并進行接種鑒定提供參考。

1 稻瘟病菌孢子的分離方法

1.1 手工直接挑取孢子的單孢分離法

張君成[2]的單孢分離法是用手工直接挑取孢子，所需材料設備比較簡單，但操作難度大，技巧性強。首先在酒精燈上將接種針針尖燒紅，然后用鑷子將針尖彎曲1 cm左右，制成所需要的接種針。用無菌刀片將清水瓊脂（WA）平板切成2 cm×1 cm的瓊脂塊，挑取一塊置于無菌的載玻片上，制成挑孢瓊脂塊。

在超凈工作臺上，取出穗頸瘟標樣，用接種針的彎曲部分輕輕觸碰標樣黏附孢子，然后沿挑孢瓊脂塊的對角線輕輕劃一下，將孢子轉移到挑孢瓊脂塊表面。將含有孢子的瓊脂塊放到載物臺上，尋找分散的單個孢子，并將其移至視野中央。用接種針輕輕靠碰視野中央的單個孢子，使孢子黏附到針尖上，然后輕輕抬起針頭，移離顯微鏡。

左手取準備好的試管斜面培養基，右手將黏有孢子的接種針小心移入試管內，在培養基斜面上將針尖快速滑動1～4次，即可將孢子釋放到培養基上，適溫培養后長成單孢菌落。

手工直接挑取單孢的方法所需材料設備簡單易得，試驗過程在一般的場地即可進行，并且適用性好，可以分離不同大小和種類的孢子，但是這種方法操作難度比較大，技巧性強，對操作人員的要求很高，初學者一般很難掌握。

1.2 連續變倍體視顯微鏡單孢分離法

張書建等[3]在平板稀釋法和震落法的基礎上進行改良，總結出了一種較為簡單、準確、快速的單孢分離法。首先對發病的組織進行保濕培養。取新采集的穗頸瘟標樣，浸泡在體積分數75%乙醇中消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次。在一次性培養皿中放入2層吸水紙或1張濾紙，加入少量無菌水，浸濕吸水紙或濾紙即可。然后把消過毒的穗頸瘟標樣放在培養皿內，蓋好后室溫保濕2～3 d，直至標樣表面出現深灰色的霉層。

用無菌的鑷子夾起已長出霉層的發病組織，在清水瓊脂（WA）平板的上方用力持續捏洗耳球，產生的氣流就會帶動孢子落在培養基上。此時，應注意標樣上不要有水珠，否則容易造成污染。然后適溫培養8～12 h，直至大多數孢子已萌發但尚未進行分枝。

將連續變倍體視顯微鏡放在超凈工作臺上，把帶有孢子的WA平板放在載物臺上，在視野中尋找剛萌發尚未進行分支的分散的單個孢子，然后用接種針輕輕挑取一小塊孢子所在位置的培養基，轉入試管斜面培養基中，且帶有孢子的一面緊貼培養基表面，適溫培養后得到單孢菌株。

稻瘟病菌的產孢過程屬于營養貧瘠型，連續變倍體視顯微鏡單孢分離法就利用了稻瘟病菌產孢的這一特點。對發病的組織先進行保濕培養，使其在貧瘠的營養條件下產孢，再盡可能地將單個孢子分離出來，可以顯著提高稻瘟病菌分離孢子的成功率。這種方法用洗耳球直接將孢子從發病標樣吹到平板培養基上，這樣可以方便地進行鏡檢分離單孢，并且連續變倍體視顯微鏡分離孢子時優于普通生物學顯微鏡，便于操作。該方法的不足之處是發病標樣上可能有其他雜菌，連同孢子一起吹到培養基上，造成污染，并且標樣上可能有多個稻瘟病生理小種，最后獲得的不一定是單孢菌株。

1.3 毛細管打孔單孢分離法

董娟華等[4]用毛細管打孔法進行單孢分離。將2 g瓊脂粉加入到100 mL無菌水中，滅菌后制成2%水瓊脂。在超凈工作臺上，用無菌移液槍吸取水瓊脂涂布在無菌載玻片上，制成厚度均勻的水瓊脂片。用無菌接種針黏取發病標樣上的孢子，并將其黏附到水瓊脂片上，然后用滅菌玻璃棒沾取無菌水，稀釋涂布孢子。在顯微鏡下觀察涂有孢子的水瓊脂片，找到分散的單個孢子后，將其移入視野中央，然后下移載物臺。取內徑為1 mm彎成直角的毛細管滅菌后，短臂端部對準物鏡鏡頭下的光斑中央，在水瓊脂上打取直徑為1 mm的瓊脂餅。然后觀察瓊脂餅上是否有目標孢子，如果沒有，則重新選取孢子，直至瓊脂餅上有單個孢子。

用無菌接種針挑取帶有目標孢子的瓊脂餅，轉入試管斜面培養基中，并使帶有孢子的一面緊貼培養基表面，適溫培養后得到純化的單個菌株。

毛細管打孔單孢分離法可操作性強，污染少，單孢分離成功率比較高，特別適合強寄生真菌的分離培養。但是操作過程有些復雜，分離速度較慢，并且所需工具制作繁瑣。

1.4 挑針轉移法

邱小燕等[5]通過組織分離、孢子懸浮液涂布和挑針轉移等步驟，研究出一種可靠并且適應性廣泛的單孢分離技術。將采集回的穗頸瘟標樣，浸泡在體積分數75%乙醇中消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次。用滅菌的鑷子夾起標樣，放在滅菌后的濾紙上吸收多余水分，然后置于燕麥片培養基平板上，27 ℃黑暗培養。

培養5～10 d后，取出已經充分產孢的稻瘟病菌，在超凈工作臺上用接種針挑取一小塊布滿菌絲的培養基，放在無菌空試管中，加入4～5 mL無菌水，力度適中地振蕩數次后制成孢子懸浮液。用玻璃棒蘸取一滴孢子懸浮液涂布在載玻片上，并在顯微鏡下鏡檢計數，將孢子懸浮液的濃度調節為40倍視野下一個孢子。將制備好的孢子懸浮液靜置2～3 min后，直接將試管上半部分的孢子懸浮液倒入WA平板中，然后用滅菌涂布器涂布均勻，并用無菌風吹干。封口膜密封后28 ℃培養10 h左右，用于后續的單孢分離。

用解剖刀將制備好的涂布有孢子懸浮液的WA平板切成1.5 cm×5.0 cm左右的小塊，然后把瓊脂塊放到載玻片上，40倍顯微鏡下調節視野，使視野中央只有分散的單個孢子。然后用解剖刀小心切下視野中央的瓊脂塊，并通過顯微鏡觀察瓊脂塊中只有一個孢子。最后用接種針挑取帶有單個孢子的瓊脂塊，轉移至試管斜面培養基中，且帶有孢子的一面緊貼培養基表面，適溫培養后得到純化的單個菌株。

挑針轉移法所需材料設備簡單，可以保證所挑單孢的可靠性，并且成功率高，適用性廣，但操作過程相對而言仍有些繁瑣。

通過對稻瘟病菌幾種分離單孢方法的優缺點進行分析，認為將發病組織進行保濕培養，產孢后用洗耳球將孢子吹到平板培養基上進行培養可以很好地分離稻瘟病菌單孢。該方法的不足之處是發病標樣上可能有其他雜菌或者多個稻瘟病菌生理小種，最后獲得的不一定是單孢菌株。但可以挑取平板培養基上的單一菌落，并分別保存以獲得單一的、純化的稻瘟病菌菌株。

2 稻瘟病菌孢子的保存方法

2.1 干燥低溫保存法

孔秀英[6]用干燥低溫的方法可以短期保存稻瘟病菌的分生孢子。首先將平板培養基上的孢子洗下制成孢子懸浮液，然后用真空泵將孢子收集在濾紙上進行干燥，干燥后的帶有孢子的濾紙放入干燥器內，-20 ℃冷凍保存。幾個月后稻瘟病菌的致病性基本沒有變化，可以在平板培養基上活化后使用。干燥低溫保存法可以短期保存稻瘟病菌株，但需要抽真空，略顯復雜。

2.2 高粱粒保存法

將高粱粒煮至八分熟，用清水沖洗幾遍直至水澄清后，瀝干水裝入錐形瓶中，塞上棉塞，牛皮紙封口，滅菌（至少40 min）后使用。在超凈工作臺，在試管斜面培養基中挑取一塊長滿菌絲的培養基放入裝有高粱粒的錐形瓶中，密封后室溫保存。7 d后，部分高粱粒長有菌絲，將其搖散擴大培養。兩周后，所有的高粱粒上即可長滿菌絲。取一些長滿菌絲的高粱粒放入小試管中，試管塞封口。大約15 d等高粱粒完全干燥后，-20 ℃冷凍保存。使用時在培養基上活化即可。高粱粒保存法可以大量地保存稻瘟病菌株，但保存過程復雜，容易發生霉變污染，并且保存時所占體積較大。

2.3 濾紙片保存法

金曉春等[7]用一種簡單可靠的濾紙片法保存稻瘟病菌分生孢子。將分離得到的稻瘟病菌單孢在試管斜面培養基上培養10 d左右，等培養基上長滿菌絲后，將濾紙片剪成若干小紙片滅菌后放入斜面中，使濾紙片緊貼斜面，2～3 d后濾紙片即可長滿孢子。取出濾紙片，在超凈工作臺中用無菌風吹干，裝入滅菌的硫酸紙袋中-20 ℃冷凍保存。使用時在平板培養基上活化即可。

濾紙片保存法所需工具簡單，操作簡便，污染較少，所占空間也小，并且經過很長一段時間后，稻瘟病菌的致病性基本沒有變化，可以很好地用來保存稻瘟病菌的孢子。

干燥和低溫是延長孢子存活期，穩定稻瘟病菌致病性的兩個主要因素，其中干燥尤為重要，而低溫只有在干燥的前提下才能發揮作用。分離的稻瘟病菌株用濾紙片法保存，平板培養基活化后仍能保持很強的活性和致病性。

通過比較和分析稻瘟病菌幾種分離和保存孢子的方法，認為用病組織保濕法分離單孢和濾紙片法保存菌種，提高了分離的效率，降低了保存的難度，為今后培養大量的稻瘟病菌并進行接種鑒定奠定了很好的基礎。

參考文獻：

[1] 劉占領，雷財林，程治軍，等.水稻稻瘟病抗性基因定位與克隆研究進展[J].作物雜志，2007（3）：16-19.

[2] 張君成.手工挑取真菌單孢子顯微操作技巧[J].植物保護，2008，34（2）：98-100.

[3] 張書建，何月秋.介紹一種簡單的真菌單孢子分離法[J].云南農業大學學報，2003，18（3）：315-316.

[4] 董娟華，羅 麗，王彩霞，等.一種強寄生病原真菌的分離方法——毛細管打孔單孢分離法[J].中國農學通報，2009，25（3）：210-212.

[5] 邱小燕，湯智鵬，張 敏，等.一種適用于多數植物病原真菌的單孢分離方法[J].安徽農業科學，2011，39（9）：5263-5264.

[6] 孔秀英.稻瘟病菌分生孢子的誘發及保存方法[J].微生物學通報，1995，22（5）：308-310.

[7] 金曉春，李志新，張海生，等.稻瘟病菌分離及保存方法研究[J].安徽農業科學，2008，36（17）：7308，7390.