豬TCAP基因轉錄因子的篩選與鑒定

喬木　程碧軍　武華玉　吳彪　劉貴生　李良華　吳俊靜　彭先文　梅書棋

摘要：克隆了豬TCAP基因1 662 bp的啟動子序列，序列分析發現其啟動子區域存在MyoD、MyoG、MEF2轉錄因子結合位點，并構建了3個轉錄因子超表達載體，分別與TCAP基因啟動子載體共轉染PK細胞。結果表明，3個轉錄因子使TCAP基因啟動子活性升高，均正調控TCAP基因的表達。

關鍵詞：豬；TCAP基因；轉錄因子；表達調控

中圖分類號：S828；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）24-6299-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.052

Abstract：In this study，1 662 bp sequence of pig TCAP gene promoter was cloned. Some specific transcription factor （MyoD， MyoG and MEF2） binding sites were found in TCAP gene promoter by bioinformatics analysis. Over-expression vectors of MyoD，MyoG and MEF2 were successfully constructed and transfected with promoter sequences， respectively. Detection analysis showed that TCAP promoter activity was significantly higher. The results indicated that transcription factors MyoD，MyoG and MEF2 could bind to the TCAP promoter sequences， and enhance its activity.

Key words：pig；TCAP gene； transcription factor； expression regulation

TCAP蛋白是一種在橫紋肌和心肌中特異性表達的蛋白，是肌聯蛋白激酶的作用底物[1]，其能調節肌原纖維的組裝和肌原纖維的翻轉[2]。研究表明，該基因與肌肉萎縮、心肌癥、肌肉營養不良、心肌損傷等相關[3-5]。

基因表達調控研究是當前分子生物學研究的熱點之一，而轉錄水平的調控是基因表達過程中最重要的第一步，轉錄因子是能與基因特定序列專一性結合，從而調節目的基因表達的蛋白質分子[6]。轉錄因子在轉錄調控過程中直接或間接地識別和結合在順式作用元件的核心序列上，參與調控靶基因的轉錄。因此篩選與鑒定基因的轉錄因子成為研究基因表達調控最為重要的一步，并為研究基因表達調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

PK細胞由動物胚胎與分子育種湖北省重點實驗室保存（采用含10%熱滅活小牛血清的DMEM培養基，于5% CO2孵育箱內37 ℃常規培養）。pGL3-basic載體購自Promega公司；限制性內切酶、連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；DMEM培養基、LipofectionAMINE2000轉染試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 質粒構建

根據豬染色體序列設計引物TpF/TpR（表1），以大白豬基因組DNA為模板，PCR擴增體系中各組分為50 ng模板DNA、1×PCR Mix、0.5 mmol/L PCR primers。PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃繼續延伸10 min。以TproF/TproR為引物，以TCAP基因啟動子擴增產物為模板，PCR擴增產物用限制性內切酶MluⅠ和XhoⅠ（Fermentas， Japan）消化后，連接到pGL3-Basic載體。

根據MyoD （NCBI，No. GU249575.1）、MyoG（NCBI，No. AY921006.1）、MEF2（NCBI， No. DQ343149.1）基因的序列，分別設計引物MyoDF/MyoDR、MyoGF/MyoGR、MEF2F/MEF2R（表1），反應程序同上，引物MyoD/MyoG PCR擴增產物經Kpn Ⅰ-EcoRⅠ酶切，引物MEF2 PCR擴增產物經Nhe Ⅰ-XhoⅠ酶切后，分別連接到pcDNA3.1載體。

1.3 細胞轉染

PK細胞經胰蛋白酶消化后，接種于24孔板中，培養達到50%～60%融合后，在清潔的EP管中用無血清培養基OPTI-DMEM稀釋1 μL 質粒DNA至60 μL，加入5 μL轉染試劑，混勻后室溫下孵育5～10 min，同時用l mL PBS清洗24孔板中的細胞1次，EP管中加入350 μL含FBS血清的細胞培養基，吹打2次混勻后立即加入到24孔板中，輕輕搖勻置37 ℃、5% CO2孵育箱培養6 h，吸走含轉染復合物的培養基，并用1 mL PBS清洗細胞1次，裂解并收集細胞進行熒光素酶活性檢測。

1.4 熒光素酶活性測定

徹底吸去各孔培養基，用PBS沖洗3遍，每孔加入細胞裂解液110 μL，冰上孵育30 min，刮下細胞并迅速收集到冰預冷的1.5 mL微量離心管中。4 ℃下12 000 r/min離心2 min，取上清液。將熒光素酶底物分析緩沖液和收集的上清置于室溫。取10 μL熒光素酶底物和50 μL細胞裂解液加入96孔板，輕輕混勻后迅速放入HTS7000多孔板閱讀器，在激發波長為430 nm、發射波長為550 nm條件下讀取熒光值。

2 結果與分析

2.1 豬TCAP基因啟動子PCR擴增結果

以大白豬基因組DNA為模板利用引物TF/TR進行 PCR反應，獲得1 662 bp的序列（圖1），經過序列比對和啟動子預測軟件分析確定為TCAP基因的啟動子序列。

2.2 豬TCAP基因啟動子序列的生物信息學分析

運用網站TFSEARCH（http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html）和TESS（http：//www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess）對豬TCAP基因啟動子區潛在的轉錄因子結合位點進行預測，發現存在MyoD、MyoG、MEF2和NF-？資B等調控肌肉生長發育的轉錄因子結合位點（圖2）。

2.3 TCAP啟動子表達載體的構建

以大白豬TCAP基因啟動子區擴增產物為模板，利用TproF/TproR引物擴增，獲得1 428 bp片段，PCR產物和pGL3-basic載體經MluⅠ和XhoⅠ酶切純化后連接，并轉化大腸桿菌DH5α，提取轉化質粒經雙酶切（圖3）和測序鑒定，證實插入片段為目的片段。

2.4 MyoD、MyoG和MEF2超表達載體的構建

以大白豬肌肉組織的cDNA為模板，利用MyoDF/MyoDR、MyoGF/MyoGR、MEF2F/MEF2R引物擴增，分別獲得960、675、1 302 bp的片段，MyoD和MyoG經限制性內切酶KpnⅠ和EcoRⅠ消化， MEF2經限制性內切酶NheⅠ和XhoⅠ消化，連接到經同樣酶切的pCDNA3.1載體中轉化大腸桿菌DH5α，提取轉化質粒經雙酶切（圖4、圖5、圖6）和測序鑒定，證實插入片段為目的片段。

2.5 超表達載體與啟動子載體的共轉染

將構建的轉錄因子超表達載體分別與啟動子序列進行共轉染，TCAP基因啟動子作為對照，發現3個轉錄因子與TCAP基因啟動子共轉染后，TCAP基因啟動子活性分別升高了2～3倍（圖7），說明豬MyoD、MyoG和MEF2正調控TCAP基因的表達。

3 小結與討論

骨骼肌的生成過程需經過形態學、組織學的變化，產生各個階段的細胞譜系，并通過終末分化形成成肌細胞，再由這些成肌細胞經過一系列的發育分化為肌纖維。成肌分化抗原MyoD、肌細胞生成素MyoG是調節肌細胞分化和控制骨骼肌生成的關鍵調節因子，在調節肌細胞分化和控制骨骼肌生成中起關鍵的調節作用[7]。肌細胞增強因子MEF2是最早在骨骼肌管核中發現的蛋白質，具有DNA的結合活性，與肌肉肌酸激酶啟動子中特異序列結合，調節肌肉形成和骨骼肌發育[8]。MyoD、MyoG、MEF2 3個調控因子在肌肉的形成與發育過程中均起重要的調控作用。

對豬TCAP基因啟動子分析發現，存在MyoD、MyoG、MEF2等調控肌肉生長發育的轉錄因子結合位點，本研究將3個調節因子超表達共轉染TCAP基因啟動子，使TCAP基因表達量顯著升高，因此可以推斷MyoD、MyoG、MEF2對TCAP基因存在正調節作用，是TCAP基因的正調控轉錄因子。

參考文獻：

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