豬鏈球菌2型1910RR蛋白多克隆抗體的制備

程堯　田永祥　劉澤文　周丹娜　段正贏　楊克禮　郭銳　劉威　袁芳艷

摘要：通過原核表達系統表達了豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）1910RR蛋白，并制備了多克隆抗體。結果表明，豬鏈球菌2型1910RR重組蛋白以上清形式表達，Western-blot檢測證實了1910RR蛋白具有良好的免疫學活性，1910RR多克隆抗體效價為1∶4，為進一步研究1910RR蛋白功能奠定了良好基礎。

關鍵詞：豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）；1910RR蛋白； 原核表達；多克隆抗體

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）24-6320-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.058

Abstract： The polyclonal antibody of 1910RR protein of Streptococcus suis type 2 was expressed and prepared. The results showed that 1910RR protein was expressed in the supernatant and has good immunological activity. The polyclonal antibodies of rabbit anti 1910RR protein was 1∶4. The preparation of polyclonal antibody was successful and can be used for function research of 1910RR protein.

Key words：Streptococcus suis type 2；1910RR protein；prokaryotic expression； polyclonal antibody

豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）是一種重要的人畜共患病原菌，可引起豬的急性敗血癥、腦膜炎、關節炎、心內膜炎、肺炎等疾病，并可引起人類腦膜炎、敗血癥等，嚴重者導致死亡[1，2]。1998年和2005年，江蘇省和四川省人流行感染SS2事件，患者出現中毒性休克綜合征[3]，引起了國內外學者對SS2的廣泛關注與研究。

SS2毒力因子種類很多，如莢膜多糖（Capsular polysaccha-ride，CPS）、溶菌酶釋放蛋白（Muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（Extracellular factor，EF）、溶血素（Suilysin，Sly）等[4，5]。由于不同菌株所具有的毒力因子各不相同，同一種毒力因子在不同菌株中的作用也不一定相同，同時單獨研究毒力因子的功能并不能深入解釋SS2的致病機制，因此研究這些毒力因子在SS2致病過程中是如何受調控并共同發揮作用將更為重要[6，7]，廣泛存在于細菌中的二元調控系統（Two-component signal transduction system，TCSTS）作為調節自身功能和毒力的中樞系統而成為研究熱點。

經典的TCS由兩部分組成，組氨酸激酶（Histidine kinase，HK）和反應調控因子（Response regulator，RR）。經典的信號通路包括外界信號輸入、HK自體磷酸化、RR磷酸化及信號輸出[8]。1910HK/RR是豬鏈球菌2型的一對雙組分調控系統，1910HK接受并傳遞外界信號刺激，反應調控因子1910RR則負責調控下游目標基因的表達或使目標蛋白的功能發生變換。本試驗克隆了豬鏈球菌2型1910rr基因，連接到原核表達載體pET-30a中，通過表達條件的摸索，成功獲得分泌性表達蛋白，制備了兔抗1910RR蛋白的多克隆抗體，為進一步研究1910RR蛋白功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達質粒pET-30a由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫室實驗室保存。Taq DNA聚合酶、限制性內切酶BamHⅠ/Hind Ⅲ及T4 DNA連接酶、E.coli DH5α、BL21（DE3）、DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；六聯組氨酸純化鎳柱、山羊抗兔IgG、HRP-DAB底物顯色試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；日本大耳兔購自湖北省實驗動物研究中心。

1.2 引物設計

參照GenBank公布的豬鏈球菌2型05ZYH33的1910rr基因核苷酸序列，用Primer5設計一對引物：上游引物RrI：5′-CGCCGGATCCATGCATAAGATGTTAGTAGTTGAT-3′，下游引物RrII：5′-CGCCAAGCTTTCATTCTGTCTGTAATTGACCGAT-3′。在上、下游引物分別引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點。

1.3 1910rr基因的擴增

使用合成的引物RrI/RrII擴增出1910rr基因后于1%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察其條帶大小是否符合預期。

1.4 pET30a-1910rr原核表達質粒的構建

1910rr基因與pET-30a經BamHⅠ/Hind Ⅲ雙酶切處理后，以T4 DNA連接酶連接，轉化到E.Coli DH5α感受態細胞中，提取質粒后BamHⅠ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定，陽性重組質粒命名pET30a-1910rr，送至北京擎科新業生物技術有限公司測序。

1.5 pET30a-1910RR融合蛋白的誘導表達

將陽性重組質粒pET30a-1910rr轉化宿主表達菌株BL21（DE3），挑取單個菌落接種于LB液體培養基（含25 mg/L卡那霉素）中，37 ℃培養箱過夜，再按1∶100比例轉接到LB液體培養基，37 ℃、180 r/min培養1.5 h后加入終濃度為0.8 mmol/L 的IPTG，22 ℃誘導12～16 h。

1.6 pET30a-1910RR融合蛋白的分離與純化

上清的制備：誘導1 L陽性重組質粒pET30a-1910rr轉化菌，10 000 r/min離心10 min收集菌體，用Buffer A重懸菌體，冰浴條件下超聲波破碎菌體（功率200 W，破碎1 s，停1 s）共破碎30次。裂解后菌液10 000 r/min離心30 min，收集上清。

上清的純化：用平衡液平衡柱子后，將上清加入Ni-NTA Beads中， 充分結合后加入20 mmol/L咪唑洗滌雜蛋白， 最后用75 mmol/L咪唑洗脫液進行洗脫，12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析蛋白純化情況。

1.7 1910RR蛋白多克隆抗體的制備

純化后的1910RR蛋白皮下多點免疫日本大耳兔，14 d免疫一次，首免前采血分離血清用于陰性對照。首免用弗氏完全佐劑，加強免疫均用弗氏不完全佐劑。前兩次蛋白免疫量為6 mg/只，第3次和第4次免疫時劑量為12 mg/只。第4次免疫后7 d采血， 用瓊脂糖免疫擴散試驗檢測抗體效價，達到預期效果后，心臟采血后37 ℃靜置1 h，10 000 r/min離心15 min分離血清，-80 ℃保存。

1.8 Western-blot鑒定重組蛋白免疫原性

將純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后將重組蛋白條帶轉移到NC膜上，5%脫脂奶37 ℃封閉過夜。TBST洗滌3次，每次10 min，以3次免疫后的兔抗1910RR蛋白血清按1∶100稀釋作為一抗。37 ℃孵育1 h， TBST洗滌3次，每次10 min，1∶5 000稀釋HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，37 ℃作用1 h， TBST洗膜3次，DAB顯色液顯色至蛋白帶清晰，去離子水終止反應。

1.9 瓊脂免疫擴散試驗檢測多克隆抗體效價

瓊脂平板打孔后，中間孔加入兔抗1910RR蛋白血清，周圍孔加入2倍倍比稀釋的重組蛋白，以此確定最佳抗原濃度；再將確定稀釋好的重組蛋白加入中間孔，周圍加入2倍倍比稀釋的兔抗1910RR蛋白血清，出現沉淀線的最大稀釋度即為抗體效價。

2 結果與分析

2.1 1910rr基因的PCR擴增結果

使用合成的引物RrI/RrII擴增1910rr基因。如圖1所示，PCR擴增出1 200 bp左右的片段，與預期片段1 290 bp大小一致。

2.2 重組表達載體的酶切鑒定

如圖2所示，pET30a-1910rr重組表達載體經BamHⅠ/Hind Ⅲ雙酶切后出現2條帶，分別在5 000 bp左右和1 200 bp左右，與預期的5 422 bp和1 290 bp條帶大小一致。陽性重組質粒pET30a-1910rr經北京擎科新業生物技術有限公司測序，1910rr基因序列完全正確且讀碼框無誤。

2.3 pET30a-1910RR融合蛋白的表達與純化

用0.8 mmol/L的IPTG分別誘導12～16 h后，轉化了重組質粒pET30a-1910rr的BL21（DE3）均表達出56 ku的融合蛋白，而且誘導量無明顯差異。以上清形式表達的重組蛋白和六聯組氨酸鎳柱結合后用75 mmol/L咪唑濃度的洗脫液進行洗脫。如圖3所示，上清純化前目的蛋白條帶很濃，而純化后的上清無目的蛋白條帶，說明目的蛋白與六聯組氨酸鎳柱的結合效果很好；洗脫液里出現明顯目的蛋白條帶，雜帶很少，得到較純凈的目的蛋白。

2.4 Western-blot鑒定重組蛋白免疫原性

將純化后的融合蛋白與重組蛋白免疫4次后的兔血清反應，Western-blot驗證血清中多克隆抗體的存在。如圖4所示，Western-blot可以檢測到在56 ku處有一明顯條帶出現，證實純化后的目的蛋白可被兔血清識別，多克隆抗體的制備是成功的。

2.5 瓊脂免疫擴散試驗檢測抗體效價

瓊脂平板打孔后，中間孔加入兔抗1910RR蛋白血清，周圍孔加入2倍倍比稀釋的重組蛋白，以此確定最佳抗原濃度為1.0 mg/mL。中間孔加1.0 mg/mL的1910RR蛋白，兔抗1910RR蛋白血清以2倍倍比稀釋，檢測結果兔抗1910RR蛋白血清效價為1∶4（圖5）。

3 小結與討論

豬鏈球菌2型SC19菌株雙組分1910HK/RR缺失后，在TSB培養基中生長速率明顯變慢，毒力顯著下降，與野生株相比有219個基因轉錄水平發生了變化，其中105個基因下調表達1.5倍以上，114個基因上調1.5倍以上[8]。因此，本研究以豬鏈球菌2型1910RR蛋白為研究對象，通過大腸桿菌原核表達系統表達豬鏈球菌2型1910RR蛋白并制備了多克隆抗體，為進一步研究1910RR蛋白功能奠定物質基礎。

原核表達系統表達的蛋白多以無活性的包涵體形式存在，包涵體主要是由于蛋白合成過快、過多、還來不及正確折疊和二硫健未能正確配對，相互聚積而成[9]。包涵體蛋白大多沒有活性，需要變性復性，而且純化效果不好。通過降低IPTG濃度、轉速、溫度等條件，降低蛋白的合成速率，可以在一定程度上增加蛋白的可溶性表達[10]。以上清形式表達的可溶性融合蛋白的His殘基是暴露的，所以其更易與六聯組氨酸鎳柱結合，純化效果要比包涵體好，而且不需要變性復性。在本研究中，重組質粒pET30a-1910rr轉化大腸桿菌表達菌株后，通過添加0.8 mmol/L的IPTG誘導，發現pET30a-1910RR融合蛋白主要以包涵體的形式表達。通過蛋白表達溫度的摸索，獲得了在低溫（22 ℃）條件下以上清形式表達的pET30a-1910RR融合蛋白。

Western-blot鑒定結果表明，制備的融合蛋白pET30a-1910RR抗血清可以與重組蛋白反應，檢測到血清中相應的多克隆抗體，說明重組蛋白具有較好的免疫原性。但是存在一些雜帶，這在多克隆抗體的制備中是比較常見的，因為應用動物免疫方法制備的多克隆抗體通常含有針對其他無關抗原的抗體和血清中其他蛋白質成分。

本研究通過原核表達豬鏈球菌2型雙組分調控系統1910HK/RR反應調控蛋白1910RR，免疫SPF日本大耳兔，制備了多克隆抗體，為運用CHIP-Seq技術研究雙組分調控系統1910HK/RR與受調控基因的作用方式，并獲得與反應調控因子1910RR蛋白結合的DNA序列及核心位點奠定物質基礎。

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